徐佳 楊瑤珺 劉曉帆 吳立潔 劉杰 戴待

2010版《中華人民共和國藥典(一部)》規(guī)定水蛭為水蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HirudonipponicaWhitman或柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全體，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥的功效，用于治療癥瘕痞塊、中風(fēng)偏癱、跌撲損傷等癥[1]。近年來，水蛭市場需求量增大，藥材質(zhì)量良莠不齊，嚴(yán)重影響其制劑的臨床療效，因此筆者采用主流品種螞蟥藥材進行指紋圖譜研究。

中藥成分復(fù)雜，單純測定少數(shù)幾種有效成分或指標(biāo)成分難以控制其質(zhì)量，因此指紋圖譜的建立能全面反映整體成分的特征，更好的評價藥材質(zhì)量[2]。近年來，指紋圖譜技術(shù)有了飛速的發(fā)展，逐漸成為建立中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的的主流手段，在中藥鑒定領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。例如，在鑒定進口藥物與國產(chǎn)藥物上面的應(yīng)用[3]，在研究相同類別化合物在不同中藥的成分表達(dá)的異同[4]，在藥材真?zhèn)舞b定方面[5]等。

但在動物類中藥的指紋圖譜方面，文獻(xiàn)報道較少，本實驗將指紋圖譜技術(shù)引入到動物類中藥材鑒定中，一方面可以解決水蛭藥材常規(guī)鑒定客觀數(shù)據(jù)缺失的弊端，另一方面由于水蛭等動物藥材的有效成分研究并不全面且成果并未得到廣泛的認(rèn)可，而指紋圖譜則可以宏觀判別水蛭的質(zhì)量，因此可以作為評價水蛭質(zhì)量數(shù)據(jù)之一。

1 材料

1.1 儀器

Sigma 3K15離心機(希格瑪公司)，Sartorious BP110S 分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，DFT-100 手提式高速中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)，高效液相色譜儀Aglient 1100(美國安捷倫公司),DAD二極管陣列檢測器(美國安捷倫公司)。

1.2 試劑

色譜甲醇( Fisher LOT126273)氯化鈉(批號：20090706，北京化工廠)，磷酸二氫鉀(批號：20111221，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，次黃嘌呤(批號：069-110811，上海寶萊生物制品公司)，黃嘌呤對照品(批號：140662-200802，中國食品藥品檢定研究院)。

1.3 樣品

經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院楊瑤珺教授鑒定為水蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman，10批水蛭藥材見表1。

表1 水蛭樣品收集表

2 方法

2.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相 0.01 mol/L磷酸二氫鉀(A)-甲醇(B)，梯度洗脫：0～40分鐘，A-B(95:5～90:10)；40～70分鐘，A-B(90:10～50:50)；檢測波長254 nm，流速0.8 ml/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μl。

2.2 色譜條件的選擇

提取方法考察：對比70%乙醇提取，超聲提取，采用生理鹽水浸提的方式，可以保留水蛭中的多種化學(xué)成分，使得指紋圖譜更加全面、有效。

流動相的確定:(1)甲醇—水梯度洗脫；(2)甲醇—冰醋酸水溶液梯度洗脫；(3)乙腈—冰醋酸水溶液梯度洗脫；(4)甲醇—磷酸二氫鉀梯度洗脫。通過選擇多種流動相系統(tǒng)比較試驗，以甲醇—磷酸二氫鉀鹽溶液為流動相，分離效果較好、各峰分離度較大、基線平穩(wěn)、保留時間適中。

檢測波長的選擇：采用二極管陣列檢測器，考察230 nm、240 nm、254 nm、280 nm等波長下的檢測情況，結(jié)果表明提取液在254 nm下指紋圖譜色譜峰數(shù)目適中，且色譜峰的信噪比大，基線平穩(wěn)，故檢測波長定為254 nm[6]。

參照物的選擇：次黃嘌呤是水蛭含量測定的對照品，具有舒張支氣管、平喘、擴張血管、降壓等作用[7]，廣泛存在于動物體內(nèi)，和水蛭的藥理作用有一定的關(guān)聯(lián)性。本實驗的對照品在文獻(xiàn)中次黃嘌呤的基礎(chǔ)上，引入黃嘌呤，在指認(rèn)方面，完善水蛭的指紋圖譜。

2.3 供試品溶液制備

取水蛭粗粉約1.25 g，置于10 ml離心管中，加生理鹽水5 ml，搖勻，浸提24小時后離心10分鐘(轉(zhuǎn)速3500 r/min)。上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對照品溶液配制

精密稱取次黃嘌呤2.52 mg，黃嘌呤2.56 mg，置于10 ml容量瓶中，以甲醇(色譜純)溶液溶解并稀釋，搖勻，制成每1 ml含次黃嘌呤0.252 mg，黃嘌呤0.256 mg的混標(biāo)溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 精密吸取5號供試品溶液，進樣量20 μl，連續(xù)進樣5次，測定指紋圖譜。以峰面積的大小選取十強峰(十強峰總面積大于總峰面積的65%)，經(jīng)計算，十強峰的相對保留時間的RSD值為0.05%～0.17%，相對峰面積的RSD值為0.3%～2.77%，RSD均小于3.0%，儀器的精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性考察 取5號供試品溶液，進樣量為20 μl，測定指紋圖譜。經(jīng)計算，十強峰的相對保留時間的RSD值為0.88%～2.57%，峰面積RSD為0.34%～2.84%，RSD值均小于3.0%，該方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 取5號供試品溶液，進樣量為20 μl，分別在2、4、6、8、12、24小時測定指紋圖譜，經(jīng)計算，十強峰的相對保留時間的RSD為0.37%～1.67%，相對保留面積的RSD為0.24%～1.33%，RSD值均小于3.0%，該方法的穩(wěn)定性良好。

表2 水蛭共有峰相對保留時間及相對峰面積

3 實驗結(jié)果

3.1 指紋圖譜及共有峰的標(biāo)定

用建立的色譜條件，對10批樣品進行測定,得到水蛭高效液相指紋圖譜，見圖2。水蛭所含成分的色譜峰在70分鐘之內(nèi)洗脫完全,有10個共有峰，對次黃嘌呤、黃嘌呤進行歸屬，并生成對照指紋圖譜，見圖3。

比較分析10批樣品的色譜圖，并計算各色譜峰的相對保留時間與相對峰面積，結(jié)果見表2。

圖1 次黃嘌呤、黃嘌呤對照品色譜圖

時間(min)圖3 水蛭對照指紋圖譜

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照S110 9520 9360 9540 9500 9230 9540 9400 6500 9450 960S20 95210 9610 9670 9770 9570 9860 9850 6500 9850 987S30 9360 96110 9620 9710 9650 9720 9750 6350 9760 982S40 9540 9670 96210 9730 9630 9810 9640 6320 9670 984S50 9500 9770 9710 97310 9710 9900 9810 6460 9830 992S60 9230 9570 9650 9630 97110 9680 9720 6270 9740 983S70 9540 9860 9720 9810 9900 96810 9850 6490 9870 994S80 9400 9850 9750 9640 9810 9720 98510 6420 9990 991S90 6500 6500 6350 6320 6460 6270 6490 64210 6430 669S100 9450 9850 9760 9670 9830 9740 9870 9990 64310 993對照0 9600 9870 9820 9840 9920 9830 9940 9910 6690 9931

由上表得知，水蛭藥材10個共有峰的的相對保留時間的RSD值在0.06%～1.31%，符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。但各自的相對峰面積差別很大，說明不同樣品的相同成分含量相差懸殊。

3.2 相似度評價

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A》，對10樣本指紋圖譜進行匹配，相似度在0.669～0.994之間(見表3)。9號樣品與對照指紋圖譜的相似度為0.669，明顯低于其他飲片的相似度。由1號至6號樣品可以看出，水蛭在原藥材階段相似度差異不大，但是將其切段炮制成飲片后，相似度差異較大，因此不同的炮制方法會直接影響水蛭飲片的化學(xué)成分的種類與含量[8]。

4 總結(jié)與討論

從水蛭的指紋圖譜可以看出，該方法的重復(fù)性較好，不同水蛭藥材的指紋圖譜相似性較高，說明不同產(chǎn)地水蛭含有的化學(xué)成分大致相當(dāng)。但是10個共有峰的相對峰面積RSD值很大，說明水蛭的共有成分含量差異很大，這可能與養(yǎng)殖方法、養(yǎng)殖環(huán)境、炮制有關(guān)。

由對照色譜可以看出，次黃嘌呤的峰面積很大，其對相似度的影響也較大，因此后續(xù)應(yīng)繼續(xù)改進提取方法與色譜條件，以平衡各色譜峰的峰面積，使數(shù)據(jù)更加具說服力。經(jīng)過對10批不同產(chǎn)地的水蛭藥材進行指紋圖譜試驗，表明所建立的檢測方法操作簡便、重現(xiàn)性好，為控制水蛭藥材的質(zhì)量提供了實驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:77.

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