張曉梅，潘 宇，魏 勉，顧方樂，呂 芳，孫 燕，董乃俊，王大新

（江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇 揚州 225001）

殼聚糖是由蝦、蟹殼提取的高分子化合物幾丁質(zhì)經(jīng)脫N-乙酰后衍生而成，具有良好的生物相容性和生物學活性，是一種新型的醫(yī)用生物材料[1-2]。本試驗旨在確定殼聚糖溶液在體外環(huán)境下對人子宮內(nèi)膜細胞的影響，為殼聚糖作為節(jié)育器材料提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

RPMI-1640型培養(yǎng)基（Sigma公司）；胰蛋白酶（Difco公司）；FBS（Hyclone 公司）；MTT（Sigma 公司）。殼聚糖（劑型為干粉，濟南海得貝海洋生物工程有限公司，商品名為脫乙酰醫(yī)藥級殼聚糖，生產(chǎn)批號為魯衛(wèi)食證字＜2007＞第370000-000052號）。人子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa細胞（上海復祥生物科技有限公司）Cell proliferation ELISA Kit（Roche），細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天公司）。

1．2 方法

細胞培養(yǎng)：在37℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)Ishikawa細胞，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基。

殼聚糖溶液配制：取殼聚糖干粉2．0 g，加入蒸餾水100 mL，再加入冰醋酸1 mL，磁力攪拌24 h，待殼聚糖完全溶解后高速離心（10 000 r／min）20 min，取上清液，得質(zhì)量濃度為 20 μg／μL 的殼聚糖溶液。

MTT檢測細胞增殖：收集處于對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于96孔板，1×104細胞／孔。24 h后加入質(zhì)量濃度梯度的殼聚糖溶液，同時加入20%的FBS和5 μg／mL的阿霉素（DOX）溶液分別作為陽性對照和陰性對照，刺激48 h后加入 20 μL 的 MTT（5 g／L），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄 MTT 溶液，每孔加入150 μL的 DMSO，震蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，570 nm波長處，檢測光吸光度。

BrdU檢測DNA合成速率：收集處于對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于96孔板，1×104個細胞／孔。24 h后加入質(zhì)量濃度梯度的殼聚糖溶液，同時加入5 μg／mL的阿霉素作為陰性對照，刺激48 h后加入10 μmol／L的BrdU，孵育8 h后用Roche ELISA Kit檢測BrdU吸光度。

流式細胞儀檢測細胞周期：收集處于對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于96孔板，1×104個細胞／孔。24 h后加入質(zhì)量濃度梯度的殼聚糖溶液，同時加入5 μg／mL的DOX作為陰性對照，刺激48 h后收集細胞，70%乙醇4℃固定過夜，PI染色后上機檢測。

2 結(jié)果

2．1 殼聚糖對Ishikawa細胞增殖的影響

為了檢測不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對Ishikawa細胞生長的影響，分別用 0，0．01，0．1，1，10，50，100 μg ／mL 的殼聚糖溶液刺激Ishikawa細胞 48 h，同時以 20%FBS和 5 μg／mL的 DOX處理 48 h作為陽性和陰性對照，用MTT檢測細胞增殖情況。從圖1可以看出，殼聚糖質(zhì)量濃度低于 100 μg／mL時，對 Ishikawa細胞的增殖幾乎沒有明顯影響（P＞0．05）；而殼聚糖質(zhì)量濃度為 100 μg／mL時與對照組比較，Ishikawa細胞增殖能力顯著增加（P＜0．05），同時陽性對照組20%FBS細胞增殖能力也顯著增加（P＜0．05），而DOX處理組細胞增殖能力極顯著降低（P＜0．01）。

圖1 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對Ishikawa細胞增值的影響

2．2 殼聚糖對Ishikawa細胞DNA合成速率的影響

為了檢測不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對Ishikawa細胞DNA合成速率的影響，分別用 0，0．01，0．1，1，10，50，100 μg ／mL 的殼聚糖溶液處理Ishikawa細胞48 h，同時用5 μg／mL的阿霉素處理48 h作為陰性對照，加入 1 μmol／L的 BrdU孵育 8 h，用 Roche ELISA Kit檢測。從圖2可以看出，低質(zhì)量濃度的殼聚糖（不大于10 μg／mL）時，與對照組比較，試驗組Ishikawa細胞的DNA合成速率沒有顯著性變化（P ＞0．05）；而殼聚糖質(zhì)量濃度達到 100 μg／mL 時，對細胞 DNA的合成速率有顯著的促進作用（P＜0．05）。同時，DOX處理組 DNA合成速率顯著降低（P＜0．01）。

圖2 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對Ishikawa細胞DNA合成速率的影響

2．3 殼聚糖對Ishikawa細胞周期的影響

為了檢測不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對Ishikawa細胞周期的影響，分別用 0，0．1，1，10 μg／mL 的殼聚糖溶液刺激 Ishikawa 細胞48 h，同時用5 μg／mL的阿霉素刺激48 h作為陰性對照，收集的細胞用70%的乙醇于4℃固定過夜，隨后PI染色，用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期分布。從表1和圖3可以看出，≤10 μg／mL質(zhì)量濃度殼聚糖對Ishikawa細胞的細胞周期幾乎沒有影響（P ＞ 0．05），即 0．1，1，10 μg／mL 質(zhì)量濃度殼聚糖處理組的細胞G1期，S期以及G2期與對照組比較無顯著性變化。而DOX處理組細胞無S期，同時G1期，G2期顯著延長，與對照組比較有顯著性差異（P ＜0．05）。

圖3 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對Ishikawa細胞周期的影響

表1 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對Ishikawa細胞周期的影響(百分率／%)

3 討論

殼聚糖是利用蝦蟹外殼廢棄物質(zhì)制成的天然高分子化合物，具有良好的生物相容性，可在人體內(nèi)完全吸收，無毒副作用，具有廣闊的臨床應用前景[3-4]。體外試驗和動物試驗表明，殼聚糖具有選擇性抑制成纖維細胞、平滑肌細胞增殖和促進表皮細胞、內(nèi)皮細胞的生長[5-7]，但對人子宮內(nèi)膜細胞的影響尚未見文獻報道。

在本研究中，首先通過MTT比色法檢測了殼聚糖對Ishikawa細胞毒性的影響，發(fā)現(xiàn)僅當殼聚糖溶液質(zhì)量濃度達到100 μg／mL時才能輕微地促進Ishikawa細胞的生長，而當殼聚糖質(zhì)量濃度低于100 μg／mL時，對細胞的生長無明顯的影響。同時，用BrdU摻入法來檢測殼聚糖溶液對Ishikawa細胞DNA合成的影響，試驗表明，殼聚糖溶液質(zhì)量濃度高于50 μg／mL后，Ishikawa細胞DNA合成速率有輕微增加，但低于50 μg／mL時對DNA合成速率則無明顯影響。MTT和BrdU試驗結(jié)果中，殼聚糖影響Ishikawa細胞的最低質(zhì)量濃度有所不同，其原因可能在于MTT比色法是從細胞水平來進行評價，而BrdU摻入法則是從分子水平來進行評價，故兩種方法的靈敏度不同。綜合考慮，選擇不影響Ishikawa細胞生長的最低殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為10 μg／mL。最后，又用不同質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液處理Ishikawa細胞后，PI（碘化丙啶）染色，細胞流式儀檢測細胞周期分布，其結(jié)果與前面結(jié)果一致，即當殼聚糖溶液質(zhì)量濃度低于10 μg／mL時，對Ishikawa細胞周期沒有明顯影響。

綜上所述，低濃度的殼聚糖溶液（≤10 μg／mL）對人子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的生長、增殖、細胞周期都沒有明顯影響，這一特性使得殼聚糖可以作為宮內(nèi)節(jié)育器的支架。

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[4]惠光艷，吳廣升，關繼東，等．殼聚糖溫敏凝膠與富含血小板血漿共混后的微觀結(jié)構(gòu)[J]．實用醫(yī)藥雜志，2012，29（1）：58-60．

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[7]邢桂榮，王敬湘．殼聚糖在醫(yī)藥領域的研究進展[J]．中國藥業(yè)，2003，12（8）：74-75．