高樹峰，徐 蓮 ，張少容，李 黎 ，汪美群，劉月輝

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，江西南昌330006)

鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)為主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)且高度保守的一種Ca2+結(jié)合蛋白，包括協(xié)助蛋白質(zhì)加工折疊、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣平衡、抑制腫瘤血管新生和參與抗原遞呈及細(xì)胞凋亡等功能。最近發(fā)現(xiàn)，CRT在臨床腫瘤的治療方面有著不可估計的應(yīng)用前景，成為研究熱點之一。

1 CRT的生物學(xué)特性

1.1 CRT結(jié)構(gòu)

CRT為生物體內(nèi)高度保守、長約3.6 kb，分子質(zhì)量46.5 ku、由單基因編碼的可溶性Ca2+綁定伴侶蛋白，屬熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)。人CRT基因位于第19號染色體p13.3～p13.2區(qū)段，由8個內(nèi)含子和9個外顯子組成，分別包含于疏水的17肽信號順序和3個功能不同的結(jié)構(gòu)端:高度保守近似球形結(jié)構(gòu)的N端、參與ER內(nèi)Ca2+儲存呈酸性的C端和中間富含脯氨酸成“延長的臂膀”式結(jié)構(gòu)的 P 端［1］。

1.2 CRT分布及功能

CRT在多種腫瘤發(fā)現(xiàn)表達(dá)，如白血病、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和肝癌等［2－3］。CRT主要存在于ER，還存在于胞膜、胞質(zhì)或胞外基質(zhì)等所謂的非ER-CRT，非ER-CRT可能成為自身抗原，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)病源［4］。最初認(rèn)為CRT主要調(diào)節(jié)Ca2+平衡，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其參與新生蛋白的加工、低聚糖的降解、抗原提呈且在細(xì)胞凋亡和抑制血管生成中也發(fā)揮重要作用［5］。其次，在綁定Ca2+調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣、增加 ER-Ca2+的蓄存、調(diào)整ER-Ca2+-ATP酶功能、控制細(xì)胞黏連和類固醇敏感性基因表達(dá)起重要作用［6］。再次，CRT還參與“ER質(zhì)量監(jiān)控”，阻止不正確折疊表達(dá)和未完整合成人類組織相容性抗原-I(HLA-I)的分泌及聚集，CRT穩(wěn)定完整的表達(dá)可促進(jìn)某些腫瘤的免疫原性凋亡［4，7］。此外，CRT 還在抑制體內(nèi)補體經(jīng)典途徑的激活、參與生殖細(xì)胞和心血管系統(tǒng)的早期發(fā)育方面起到密切作用［8］。

1.3 CRT調(diào)節(jié)機制

CRT可增加胞內(nèi)Ca2+通過ER的流動，同時降低線粒體Ca2+的濃度并降低膜電位，因此，Ca2+在ER和線粒體間的周轉(zhuǎn)增加可能會損壞線粒體，此可使腫瘤細(xì)胞對凋亡信號刺激的感受性增強。另外CRT過表達(dá)的腫瘤對放、化療誘發(fā)的細(xì)胞凋亡更敏感，還可通過改變Ca2+穩(wěn)態(tài)、阻止Akt信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)P53功能，以調(diào)整其誘發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，凋亡細(xì)胞表面的CRT還能被樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)識別，促進(jìn)凋亡細(xì)胞被清除，參與抗原提呈和活化特異性免疫應(yīng)答［4］。近年來研究表明CRT從ER移位到胞膜是凋亡細(xì)胞免疫原性的重要標(biāo)志，決定特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生［9～13］。蒽環(huán)類藥物亦能快速誘導(dǎo)HSP90和HSP70的膜外翻以及HMGB-1的釋放，通過TLR4受體HMGB-I可促進(jìn)凋亡細(xì)胞向DCs提呈，經(jīng)藥物處理的腫瘤細(xì)胞能激活DCs并增強吞噬，而此后的DCs可激活釋放γ-IFN的特異性CD4+、CD8+CTL，并誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生［14－15］。

1.4 CRT與凋亡細(xì)胞的清除

凋亡細(xì)胞的清除是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本生理過程，主要靠吞噬細(xì)胞的有效識別和吞噬。而CRT、HMGB-l、HSP等特征性的蛋白分子可激發(fā)體內(nèi)免疫細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的有效識別與攻擊，所以作為特異性識別信號的CRT對凋亡細(xì)胞的有效識別及清除起關(guān)鍵作用，是吞噬過程中的重要膜配體分子。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，CRT會發(fā)生簇集，成為被吞噬細(xì)胞表面的清道夫受體LDL相關(guān)蛋白所能識別的與Ps、C1q形成的“來吃我”信號識別復(fù)合體，從而啟動清除、吞噬的過程［4，16］。結(jié)腸癌細(xì)胞CT26用蒽環(huán)類藥物處理后:胞膜表面CRT呈高表達(dá)并團狀聚集，而特征性的凋亡細(xì)胞表現(xiàn)PS外翻在用藥數(shù)小時后才會出現(xiàn)。同時，可快速誘導(dǎo)CRT膜轉(zhuǎn)位，促使凋亡細(xì)胞被DCs等識別并呈遞給CD4+和CD8+CTL，從而激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答［9］。

1.5 CRT與腫瘤免疫原性

CRT的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，利于殘瘤清除，這為抗腫瘤治療提供了一種有效的免疫靶點。研究發(fā)現(xiàn)在凋亡早期胞膜表面的CRT改變可引起有效識別、攻擊腫瘤的免疫原效應(yīng)［5］。而增強CRT表達(dá)的蛋白磷酸酶GADD34抑制劑或重組CRT與絲裂霉素C和依托泊苷等聯(lián)合使用，可把非免疫原性的腫瘤細(xì)胞死亡轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)為免疫原性死亡［9］。雖然不同的化療藥物能通過相同的細(xì)胞凋亡方式來殺死腫瘤，但激活免疫力的能力卻不盡相同，ER-CRT移位到胞膜表面是DCs識別和吞噬壞死腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵過程，葸環(huán)類藥物和γ射線可誘導(dǎo)CRT移位，因此，消除CRT的存在也消除了葸環(huán)類藥物誘導(dǎo)的免疫原性，即誘導(dǎo)CRT移位的藥物或外源性CRT均可加強凋亡細(xì)胞的免疫原性［17］。另CRT本身具有較強的免疫佐劑功能，胞膜上的多糖分子能與CRT相互結(jié)合，此可促進(jìn)B細(xì)胞活化與成熟，致相應(yīng)抗體的產(chǎn)生［18］。

2 CRT的臨床應(yīng)用研究

2.1 CRT與機體致瘤

在腫瘤轉(zhuǎn)化形成中多種抗原同時也會產(chǎn)生，為阻止腫瘤形成，機體免疫系統(tǒng)通過啟動針對新抗原的免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞。研究指出:由CD8+CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機體腫瘤排斥方面起重要作用，但腫瘤抗原并不能被CTL完整識別，抗原肽MHC-I分子復(fù)合體才被有效識別，而在ER中腫瘤抗原被降解加工成短肽并與裝載到MHC-I分子復(fù)合體的肽結(jié)合后一起被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面供CTL識別。細(xì)胞系(K42)CRT-其抗原肽正確裝載下降50% ～80%，并影響CTL對2/3抗原肽的有效識別，而轉(zhuǎn)染CRT基因后則能恢復(fù)上述功能的正常化［19］。CRT N端序列能抑制血管生成、內(nèi)皮增生和腫瘤形成。除此，把從AML和膀胱癌患者中提取的CRT+腫瘤細(xì)胞種植于裸鼠與種植CRT－形成的腫瘤對比，顯示CRT+組有功能性活力和致瘤潛能［2］。

2.2 CRT與腫瘤的診斷及預(yù)后

不能早期診斷而錯過最佳治療時機是腫瘤患者死亡率高的一個重要原因，追其根源就是早期缺乏敏感性強、特異性高的腫瘤標(biāo)記物，所以尋找利于腫瘤早期診斷的標(biāo)記物至為關(guān)鍵，而多種瘤中CRT及其裂解片段較正常組織有明顯量的改變，提示其可能成為合適的新腫瘤標(biāo)記物。膀胱癌的研究中通過檢測尿中CRT發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量也明顯增加，考慮是否將CRT作為潛在生物學(xué)標(biāo)記應(yīng)用于早期診斷［3］。另外，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和結(jié)腸癌中CRT的高表達(dá)直接關(guān)系到腫瘤的進(jìn)展，尤其表現(xiàn)在高度惡性和低分化區(qū)域，表明CRT與腫瘤的生長、分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有直接關(guān)系［20］。

2.3 CRT與腫瘤的基因治療

CRT與腫瘤的演化密切關(guān)聯(lián)，與腫瘤特異性抗原形成的CRT識別復(fù)合體被DCs識別和吞噬能提高M(jìn)HC-I類分子的折疊處理及抗原提呈能力，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生、活化特異性CD8+CTL并形成適應(yīng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答。牛痘疫苗是特異性抗原免疫治療的重要載體，將CRT與HPV16型E7、牛痘疫苗相連組成Vac-CRT-E7融合疫苗對小鼠進(jìn)行腹腔注射，示融合疫苗組產(chǎn)生的特異CD8+CTL較單獨使用腫瘤特異性抗原肽或CRT免疫產(chǎn)生的效果更明顯，實驗組 E7特異IL-2及TNF-γ干擾素分泌性 CD8+CTL激活比例增多，并對表達(dá)E7的腫瘤產(chǎn)生顯著抗瘤效應(yīng)，提示此融合疫苗可作為腫瘤基因治療研發(fā)的新策略［21－22］。將CRT與胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)基因重組，再轉(zhuǎn)染至鼠黑素瘤細(xì)胞表達(dá)出CRT-GPCRs融合蛋白，觀察到實驗鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出很強的抗同種瘤的抗原呈遞殺傷效應(yīng)，提示此重組細(xì)胞具備用于高級哺乳動物腫瘤疫苗的潛在實用價值［10］。另用CRT-E7融合基因的腺病毒攜帶載體和含E7-CRT的基因疫苗免疫小鼠，荷瘤小鼠不但產(chǎn)生了明顯的抗瘤效應(yīng)，且誘導(dǎo)并強化了免疫記憶細(xì)胞，為腫瘤治療性疫苗的研究邁出了關(guān)鍵一步［21］。

2.4 CRT與腫瘤的放療

神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4細(xì)胞中的CRT表達(dá)高于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(U25lMG和T98G)，其對γ射線的敏感性顯示前者遠(yuǎn)高于后者;同時，將CRT基因?qū)氲捅磉_(dá)CRT的U251MG并檢測CRT過表達(dá)，同樣放射當(dāng)量下，導(dǎo)入CRT基因組輻射誘導(dǎo)的凋亡明顯高于未轉(zhuǎn)染組，并導(dǎo)致Ca2+依賴性的Akt脫磷酸與失活的蛋白磷酸酶2Aca表達(dá)的上調(diào)，Akt途徑的細(xì)胞存活信號在此過程中受到明顯抑制，最終增強放射誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用，證實了CRT可提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放射的敏感性，這為易產(chǎn)生耐受且對放療敏感的惡性腫瘤治療提供了另一條路徑。但基礎(chǔ)研究中其他腫瘤放療敏感耐受性實驗探究尚有待陸續(xù)展開［22］。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，CRT在腫瘤綜合診治方面有著廣闊的應(yīng)用前景:在腫瘤胞膜的表達(dá)能促進(jìn)其免疫原性凋亡，利于殘瘤清除，通過與自身抗原復(fù)合物結(jié)合抑制補體激活和協(xié)助抗體入胞等，為疾病提供了有效的免疫治療靶點;近年證實CRT還可增強腫瘤對化療的敏感性，為腫瘤的基因治療和放療提供了新策略;因多種腫瘤CRT表達(dá)較正常細(xì)胞有明顯改變，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切關(guān)連，有望在腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷方面發(fā)揮作用。但是，CRT單獨或聯(lián)合其他基因的綜合治療性實驗研究還有待進(jìn)一步證實;另外，CRT的實驗研究成果要真正應(yīng)用臨床還有待可行性臨床試驗證實，此已成為領(lǐng)域內(nèi)研究熱點，有望成為臨床腫瘤綜合治療中的一道新曙光。

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