孫宏晨，朱 陽，姜力銘，李道偉，王丹丹，唐宇欣

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021)

在骨缺損修復(fù)中生物材料引起的免疫反應(yīng)對骨微環(huán)境影響的研究進(jìn)展

Progressresearchoninfluenceofimmuneresponseinducedbybiomaterialsinhealingbonedefectinbonemicroenvironment

孫宏晨，朱 陽，姜力銘，李道偉，王丹丹，唐宇欣

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021)

局部應(yīng)用生物材料促進(jìn)骨組織再生是骨缺損修復(fù)的重要手段。目前研究認(rèn)為：生物材料植入骨缺損后可以引起機(jī)體的固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，這些反應(yīng)既可以阻礙生物材料更好地發(fā)揮成骨作用，也可以通過直接調(diào)節(jié)成骨和破骨細(xì)胞的活化及分化最終調(diào)節(jié)骨形成；此外，骨組織的形成和修復(fù)與機(jī)體其他組織如脂肪組織也有密切關(guān)聯(lián)。因此，本文作者以生物材料植入骨缺損處引起的固有免疫及適應(yīng)性免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，對骨組織、脂肪組織和免疫系統(tǒng)間的相互作用的最新研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

骨；生物材料 ；免疫反應(yīng) ；微環(huán)境 ；骨免疫

生物材料可以模仿正常組織并通過引導(dǎo)骨細(xì)胞黏附和增殖，刺激骨缺損部位的骨再生，因而在骨再生領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。但是，生物材料的植入既可通過免疫反應(yīng)與機(jī)體結(jié)合的更為緊密，又可能因慢性炎癥反應(yīng)和異物反應(yīng)而缺少預(yù)期功能[1]。因此，掌握生物材料植入骨缺損引起的免疫反應(yīng)及其對骨微環(huán)境的影響對改進(jìn)生物材料性質(zhì)，使其更好的發(fā)揮成骨效應(yīng)具有重要的理論意義。

1 生物材料植入骨缺損引起的固有免疫

生物材料植入骨缺損后，在材料與機(jī)體接觸瞬間，血液中的細(xì)胞間質(zhì)和蛋白質(zhì)就吸附于生物材料表面形成臨時基質(zhì)。這層蛋白質(zhì)決定了凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)、血小板和免疫細(xì)胞及其調(diào)節(jié)因子的激活，并調(diào)節(jié)其相互作用，最終導(dǎo)致臨時基質(zhì)形成，啟動炎癥反應(yīng)。

1.1 凝血途徑啟動 生物材料上的凝血作用需要表面激活和血小板的黏附激活作用相結(jié)合。研究[2]證實(shí)：與生物材料的表面接觸可以催化因子XⅡ(FactorXⅡ，F(xiàn)XⅡ)激活為FXⅡa。而FXⅡa激活FXⅠ成為FXⅠa，從而啟動內(nèi)源性凝血途徑。血小板的主要激活劑是凝血酶，F(xiàn)XⅡ連接于生物材料，釋放較低濃度的凝血酶即可激活血小板，隨后血小板釋放凝血因子并暴露帶負(fù)電荷的磷脂，為凝血系統(tǒng)提供了所謂的“催化表面”[3]。凝血酶裂解纖維蛋白原為纖維蛋白，產(chǎn)生生物材料周圍最初的纖維網(wǎng)絡(luò)。纖維蛋白原通過黏附于生物材料表面使構(gòu)象發(fā)生改變，暴露2個整合素的結(jié)合位點(diǎn)，通過整合素結(jié)合于白細(xì)胞并使之活化，在血凝塊形成后生理性地產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。生物材料上吸附的纖維蛋白原還能作為血小板的黏附基質(zhì)[4]。除了凝血酶和吸附的纖維蛋白原的作用，損傷的細(xì)胞或活化的白細(xì)胞中表達(dá)組織因子(tissue factor，TF)，TF激活補(bǔ)體，引導(dǎo)與生物材料連接的血小板活化[5]。

1.2 補(bǔ)體在材料表面激活 在生物材料與血液接觸后，補(bǔ)體通過一系列作用激活，并發(fā)揮清除體內(nèi)外來物質(zhì)的宿主防御作用。傳統(tǒng)理論認(rèn)為補(bǔ)體主要通過經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin pathway，MBL)途徑及旁路途徑激活。然而最近的研究結(jié)果[6]使這種理論受到了挑戰(zhàn)，在血液-材料反應(yīng)中，補(bǔ)體與各個誘發(fā)血栓和炎癥的級聯(lián)系統(tǒng)以及血小板和白細(xì)胞間具有緊密的交叉效應(yīng)，例如：FVⅢ與血管性血友病因子(VWF)的復(fù)合體具有凝集素活性；而C1抑制劑(C1INH)不僅可以封閉所有的補(bǔ)體通路，還能封閉內(nèi)源性凝血通路；補(bǔ)體系統(tǒng)重要的中間產(chǎn)物(如C5a)能夠直接由凝血酶產(chǎn)生。

1.3 急慢性炎癥反應(yīng) 在血液-材料反應(yīng)和臨時基質(zhì)形成后，機(jī)體即可發(fā)生急慢性炎癥反應(yīng)。炎癥程度是由損傷程度、植入部位和臨時基質(zhì)的范圍決定的。Reichel等[7]研究顯示：在組織和生物材料之間有炎性細(xì)胞的募集，早期階段為多形核中性粒細(xì)胞，后期為單個核細(xì)胞(如單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)。生物材料介導(dǎo)的急性炎癥和慢性炎癥反應(yīng)通常是短期而局限的，在急慢性炎癥反應(yīng)后，材料存在的微環(huán)境內(nèi)會含有大量的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，而后肉芽組織逐漸形成。在Caetano-Lopes等[8]的慢性炎癥動物模型中發(fā)生骨密度降低及骨組織模式的改變，這說明炎癥反應(yīng)損傷骨的力學(xué)性能，即剛性、延展性和強(qiáng)度，這一結(jié)論支持免疫系統(tǒng)影響骨的代謝、結(jié)構(gòu)和功能的假說。Velard等[9]研究發(fā)現(xiàn)：羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)顆粒激發(fā)了積極的炎癥反應(yīng),并產(chǎn)生幾種對骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)有害的介質(zhì)，引起破骨細(xì)胞活化，導(dǎo)致骨質(zhì)溶解。細(xì)胞吞噬生物材料碎片后釋放多種細(xì)胞因子，而大多數(shù)引起破骨細(xì)胞活化的介質(zhì)是由這些吞噬了材料的巨噬細(xì)胞所合成的。

1.4 異物反應(yīng) 生物材料導(dǎo)致的異物反應(yīng)有2個主要條件：合適的引導(dǎo)融合的刺激物和有適合蛋白質(zhì)吸附的材料表面[10]。在血液-材料反應(yīng)之后，血小板和血凝塊釋放趨化物，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞趨向創(chuàng)傷部位。巨細(xì)胞脫粒和組胺釋放也使巨噬細(xì)胞向植入部位聚集并使后期的趨化物增多，引導(dǎo)更多巨噬細(xì)胞集中在植入部位[11]。巨噬細(xì)胞在聚集之后會通過整合素調(diào)節(jié)偽足而相互靠近，并相互融合成為異物巨細(xì)胞。但導(dǎo)致巨噬細(xì)胞融合的確切分子機(jī)制尚未完全闡明。有研究[11]顯示：多種細(xì)胞因子發(fā)揮作用，如白細(xì)胞介素4(IL-4)、CD44和CD47、樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)、CC趨化因子配體2(CCL2)等。巨噬細(xì)胞和異物巨細(xì)胞可以在細(xì)胞和生物材料間的區(qū)域釋放降解性介質(zhì)，如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，降解酶和酸等，這種局限性空間會推遲或減少機(jī)體對這些介質(zhì)的緩沖或抑制作用[12]。

1.5 固有免疫的抑制 目前針對生物材料應(yīng)用的凝血抑制劑有肝素、凝血酶抑制劑(美拉加群)、TF抑制劑、活化蛋白C和低相對分子質(zhì)量的硫酸葡聚糖等[13]，但是全身應(yīng)用凝血系統(tǒng)的抑制劑能夠增加出血和感染的風(fēng)險(xiǎn)。而在生物材料或細(xì)胞表面應(yīng)用肝素涂層時可以降低這種風(fēng)險(xiǎn)，同時能夠使血漿蛋白僅以特異性或非特異性電荷與生物材料連接，這種連接對血漿蛋白的構(gòu)象改變較小而不足以被激活。另一種類似的方法是聚乙二醇涂層，其發(fā)揮作用是通過增加材料和細(xì)胞表面的親水性，從而阻止蛋白質(zhì)的吸附，并隱藏材料的表面結(jié)構(gòu)，最終阻斷凝血系統(tǒng)的激活[14]。這2種方法的不足之處在于會同時使材料表面完全沒有細(xì)胞吸附。在抑制補(bǔ)體方面，APT070、因子H、衰變加速因子(decay accelerating factor,DAF)、補(bǔ)體受體2(completement receptor 2,CR2)等補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)劑(regulator of complement activation,RCA)與生物材料混合應(yīng)用能夠減少補(bǔ)體在生物材料表面沉積，并抑制其激活[13]。

2 生物材料植入骨缺損引起的適應(yīng)性免疫

適應(yīng)性免疫通過體液免疫及細(xì)胞免疫發(fā)揮作用，其根本在于淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子。因此，了解生物材料植入后引起的淋巴細(xì)胞反應(yīng)及其對骨微環(huán)境的影響具有重要意義。

2.1 單純植入生物材料 生物材料單純植入機(jī)體時，淋巴細(xì)胞反應(yīng)相對來說并不明顯，主要取決于生物材料的抗原性。Rudra等[15]研究顯示:螺旋超分子材料在接種動物后激發(fā)的抗體反應(yīng)與其空間構(gòu)象有關(guān),空間構(gòu)象復(fù)雜的材料可以激發(fā)中等程度的抗體反應(yīng)，而構(gòu)象相對簡單的抗體反應(yīng)十分微弱。由于干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)和IL-2的產(chǎn)生無明顯變化，因此缺少經(jīng)典的T淋巴細(xì)胞活化。Hamdy等[16]研究顯示:甘露糖修飾的PLGA-OVA納米微球相較于無甘露糖修飾的PLGA-OVA納米微球的抗原性更強(qiáng)，后者激發(fā)的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)幾乎不可測。

2.2 生物材料復(fù)合成骨活性成分 當(dāng)生物材料與細(xì)胞、蛋白質(zhì)或其他具有成骨活性的成分混合時，免疫反應(yīng)對這些物質(zhì)的活性會造成一定影響。其中，最主要的問題在于宿主與外源性細(xì)胞的相互作用。生物材料載ASCs修復(fù)股骨缺損的研究[17]表明：在植入材料2周后CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在材料植入?yún)^(qū)聚集。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是異體細(xì)胞移植失敗的主要原因，機(jī)制在于外源細(xì)胞的同種異體主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子被宿主抗原呈遞細(xì)胞處理引起CD4+T細(xì)胞的同種識別，還能夠通過分泌IFN-γ和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。在干細(xì)胞促骨形成方面，促炎的T淋巴細(xì)胞通過IFN-γ降低干細(xì)胞內(nèi)Runx-2通路并增強(qiáng)TNF-α信號，抑制外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)介導(dǎo)的骨修復(fù)的能力[18]。

2.3 生物材料對免疫細(xì)胞的作用 不同性質(zhì)的生物材料(如親水性和正負(fù)電荷等)對免疫細(xì)胞的作用也不同，因此可以在不改變外源細(xì)胞的情況下改變材料性質(zhì)，使外源細(xì)胞保存并發(fā)揮功能。同時，生物材料有時具有免疫毒理作用，聚對二氧環(huán)己酮-I型膠原(PDO-CI)體外實(shí)驗(yàn)表明這種材料對小鼠固有免疫能力沒有影響，但是對抗體形成細(xì)胞的功能具有抑制作用[19]。

3 免疫系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)及脂肪組織間的作用

在骨髓微環(huán)境中，免疫細(xì)胞和脂肪細(xì)胞是與骨細(xì)胞共存，生物材料的植入引起骨髓微環(huán)境發(fā)生變化，因此可以通過各系統(tǒng)間的相互作用對成骨作用產(chǎn)生影響。

3.1 免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng) 活化的T和B淋巴細(xì)胞均能夠表達(dá)核因子-κb受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，誘導(dǎo)自體外周單核細(xì)胞形成破骨細(xì)胞。但是Onal等[20]在卵巢切除小鼠的研究中顯示：由B細(xì)胞表達(dá)的RANKL在調(diào)節(jié)骨代謝中具有直接作用：特異性敲除小鼠T細(xì)胞的RANKL并沒有改變卵巢切除引起的骨流失，但是缺少RANKL表達(dá)的B細(xì)胞通過抑制破骨細(xì)胞局部減少骨流失?？笴D20抗體的治療效果也突出了B細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用[21]。此外，Th17由于表達(dá)較高水平RANKL及前炎癥因子被認(rèn)為是經(jīng)典的破骨細(xì)胞形成途徑。Th17還能表達(dá)IL-17，引導(dǎo)基質(zhì)降解酶(如MMPs)合成，引導(dǎo)骨和軟骨降解，而Th1和Th2亞群能通過分泌細(xì)胞因子抑制Th17亞群。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)調(diào)節(jié)這些Th亞群間的平衡，并且通過細(xì)胞間接觸及細(xì)胞因子抑制破骨細(xì)胞形成。因此，在病理?xiàng)l件下，T淋巴細(xì)胞表達(dá)的積極因子和消極因子間的平衡將影響破骨細(xì)胞生成[22]。Cain等[23]已經(jīng)證實(shí)：破壞硬化蛋白能夠增加B細(xì)胞凋亡導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)目降低。硬化蛋白主要在骨細(xì)胞而非任何造血系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)，顯示骨組織能夠通過調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

3.2 骨骼系統(tǒng)與脂肪組織 Zara等[24]研究顯示：當(dāng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2 ,BMP2)的濃度適宜時會促進(jìn)骨形成，而當(dāng)BMP2濃度較高時，會由于其趨化淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞至骨缺損處從而出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，此外還在骨缺損處出現(xiàn)內(nèi)含脂肪組織的囊樣骨。高劑量BMP2可以活化過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)，從而增加c-fos表達(dá)，c-fos是破骨細(xì)胞形成的基本介質(zhì)，由此增加破骨細(xì)胞生成引起骨吸收。另外，PPAR-γ上調(diào)可以直接抑制無翅及小鼠乳房腫瘤病毒結(jié)合位點(diǎn)蛋白家族(Wnt)使脂肪形成增加，并抑制成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)，促進(jìn)BMSCs向成脂方向分化。脂肪組織也可以通過分泌瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素和抵抗素等脂肪因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用并與慢性炎癥相關(guān)。瘦素對骨代謝的作用有2種：一是通過與骨的受體作用，促進(jìn)前成骨細(xì)胞發(fā)展并刺激成骨細(xì)胞形成新骨；二是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)降低成骨細(xì)胞活性[22]。

4 展 望

生物材料在骨缺損修復(fù)應(yīng)用中要與細(xì)胞、蛋白質(zhì)和其他生物成分混合。在骨缺損區(qū)可能會遇到不同于正常組織內(nèi)的炎癥因子和信號分子,使不同類型細(xì)胞產(chǎn)生活化、分化、增殖和遷移等不同的反應(yīng)。材料及其表面的細(xì)胞可能會面臨低pH值、ROS和降解酶等微環(huán)境，從而抑制骨修復(fù)。因此，材料工程必須保持材料的性質(zhì)功能，并保護(hù)其中的生物活性物質(zhì)。另外，生物材料長期存在并發(fā)揮功能的關(guān)鍵在于其不引起有害的免疫反應(yīng)，所以需要設(shè)計(jì)激發(fā)必要免疫學(xué)產(chǎn)物的生物材料，隨著免疫學(xué)與材料學(xué)的飛速發(fā)展以及兩者間的緊密結(jié)合，研究者會找到幾種相關(guān)機(jī)制的交叉點(diǎn)，從而支持生物材料的骨缺損修復(fù)。

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1671-587Ⅹ(2013)05-1063-04

10.7694/jldxyxb20130541

2013-04-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助課題(30830108)

孫宏晨(1964-)，男，黑龍江省哈爾濱市人，教授，醫(yī)學(xué)博士，高分子化學(xué)與物理學(xué)博士后，主要從事頜骨重塑機(jī)制以及納米材料與轉(zhuǎn)基因治療研究。

孫宏晨(Tel：0431-88796010，E-mail：hcsun@mail.jlu.edu.cn)

R318.06

A