張?jiān)?，張燕萍，王?shū)臣，林加楊，樊茂蓉

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京100091；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理671000）

張?jiān)?，2，張燕萍1，王書(shū)臣1，林加楊1，樊茂蓉1

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京100091；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理671000）

目的：探討益腎活血平喘合劑對(duì)哮喘大鼠氣道TGF β1表達(dá)的影響。方法：健康雌性SD大鼠60只。隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、益腎活血平喘合劑組，每組15只大鼠。除正常組外，其余3組均利用哮喘模型。各組于造模后14 d開(kāi)始每天給藥及霧化吸入。造模后28 d處死動(dòng)物，取同一部位肺葉，包埋，切片，HE染色及免疫組化檢測(cè)氣道TGF β1的表達(dá)。結(jié)果：益腎活血平喘合劑組氣道TGF β1的表達(dá)明顯少于模型組（P<0.01）及陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：益腎活血平喘合劑通過(guò)抑制氣道TGF β1的表達(dá)，減輕哮喘氣道炎癥及重塑的發(fā)生。

益腎活血平喘合劑；哮喘；TGF β1

支氣管哮喘在病理學(xué)上的主要改變是氣道炎癥和氣道形態(tài)學(xué)上的變化（即氣道重塑）。氣道炎癥和氣道重塑互為因果，最終使肺功能發(fā)生進(jìn)行性損害〔1〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF β1）是哮喘氣道炎癥和氣道重塑過(guò)程中重要的信號(hào)傳遞調(diào)控因子。嗜酸性粒細(xì)胞、氣道上皮、巨噬細(xì)胞及纖維母細(xì)胞是氣道中TGF β1的主要來(lái)源。TGF β1在哮喘氣道炎癥和纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，比如促進(jìn)炎性細(xì)胞及纖維母細(xì)胞的產(chǎn)生及趨化，致使炎癥反應(yīng)發(fā)生；刺激膠原物質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)等物質(zhì)的合成和分泌，導(dǎo)致氣道纖維化；破壞基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶抑制因子的平衡，致使基質(zhì)沉積，氣道管腔變窄；使肌成纖維細(xì)胞增多，促進(jìn)膠原的合成和血管的生成，導(dǎo)致氣道壁增厚〔2〕。益腎活血平喘合劑是我們?cè)谂R床上治療哮喘反復(fù)發(fā)作、遷延不愈一種較好的方藥，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)免疫組化的方法觀察益腎活血平喘合劑對(duì)哮喘大鼠氣道TGF β1的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組健康雌性SD大鼠60只，體重（200±10）g。購(gòu)自北京市通利試驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)（許可證編號(hào)：SOXK（京）2002-0203）。隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、益腎活血平喘合劑組。

1.2 藥物與試劑益腎活血平喘合劑由補(bǔ)骨脂、生地、赤芍、川芎、炙麻黃、杏仁、茯苓、穿山龍、炙甘草等藥物組成，含生藥量4 g/mL，北京西苑醫(yī)院制劑室制備（批號(hào)：20050321）；地塞米松針劑（濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司）；卵白蛋白（OVA）購(gòu)自Sigma公司；氫氧化鋁購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；滅活百日咳菌苗購(gòu)自北京生物制品所；免疫組化染色試劑盒購(gòu)自ZYMED公司；抗TGF β1抗體購(gòu)自Santa Cruz生物公司；3.5%水合氯醛購(gòu)自北京西苑醫(yī)院制劑室。

1.3 主要儀器和設(shè)備醫(yī)用霧化器（402型）（上海合力醫(yī)療器械廠）；臺(tái)式離心機(jī)（80-2）（上海醫(yī)療器械廠）；石蠟切片機(jī)和圖像分析系統(tǒng)（LEICAQ550CW）（德國(guó)LEICA公司）。

1.4 造模與給藥參照文獻(xiàn)〔3-4〕方法，每只造模大鼠腹腔注入1 mL含100 mg OVA、100 mg氫氧化鋁、5×109滅活百日咳菌苗的生理鹽水混懸液（定義為第1 d），14 d后將動(dòng)物置于密閉噴霧箱，給予1%的OVA生理鹽水超聲霧化吸入，直至大鼠出現(xiàn)呼吸急促、喘息癥狀明顯的哮喘樣發(fā)作，每次約20 min，共持續(xù)14 d。正常組用同樣操作以生理鹽水處理動(dòng)物。給藥：每天霧化前30 min，正常組及模型組用生理鹽水灌胃；地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射地塞米松，劑量為0.5 mg/kg；益腎活血平喘合劑組給予益腎活血平喘合劑灌胃0.45 g生藥/100 g。

1.5 肺組織病理學(xué)第28 d，末次激發(fā)結(jié)束后5～8小時(shí)內(nèi)，處死大鼠，取大鼠右肺下葉同一部位標(biāo)本，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.6 大鼠氣道TGF β1的表達(dá)采用免疫組化ABC法，按抗TGFβ1抗體即用型免疫組化試劑盒提供方法操作，光鏡下觀察氣道TGF β1的變化，并用LEICA-Q550CW圖像分析系統(tǒng)測(cè)定氣道TGF β1的相對(duì)含量。每組取來(lái)自3只大鼠的3張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野進(jìn)行圖像分析，分別測(cè)定平均光密度值（OD值）。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間比較采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化HE染色顯示：正常組氣道壁薄，氣管黏膜結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔窄，氣道平滑肌薄，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔透亮，無(wú)炎性物質(zhì)滲出。模型組氣道壁明顯增厚，氣道黏膜皺襞增多，肺泡隔增厚，氣道平滑肌的厚度明顯增加，肺泡間質(zhì)、黏膜下及管壁均有大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道腔狹窄，氣道腔內(nèi)充填大量液體物質(zhì)。陽(yáng)性對(duì)照組氣道壁增厚皺襞增多，但較模型組輕，肺泡隔及氣道平滑肌的厚度與模型組相似，支氣管及肺泡炎性細(xì)胞浸潤(rùn)輕于模型組。益腎活血平喘合劑組氣道壁及皺襞輕微增厚，肺泡隔及氣道平滑肌的厚度比陽(yáng)性對(duì)照組薄，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與陽(yáng)性對(duì)照組相似。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色顯示不同實(shí)驗(yàn)組氣道形態(tài)變化

2.2 免疫組化測(cè)定各組大鼠氣道TGF β1表達(dá)的變化模型組反應(yīng)最強(qiáng)，呈深棕色；地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、益腎活血平喘合劑組陽(yáng)性稍弱，漸呈棕黃色至淺黃色；正常組陽(yáng)性進(jìn)一步減弱，呈淡淺黃色，見(jiàn)圖2。每組取來(lái)自3只大鼠的3張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野進(jìn)行圖像分析。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如下：模型組（0.50±0.036）與正常組（0.41±0.024）比有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組（0.45±0.034）與模型組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.015）；益腎活血平喘合劑組（0.41±0.054）與模型組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）；益腎活血平喘合劑組與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.035）。見(jiàn)圖3。

圖2 免疫組化顯示不同實(shí)驗(yàn)組TGFβ1的表達(dá)

圖3 大鼠氣道上皮TGF β1表達(dá)的OD值

3 討論

我們用卵蛋白等試劑連續(xù)致敏大鼠后，大鼠喘息癥狀明顯；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在肺泡間質(zhì)及管壁黏膜下出現(xiàn)了大量嗜酸性粒細(xì)胞〔5〕、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道壁增厚、平滑肌肥大、管腔狹窄。與文獻(xiàn)〔3-4〕報(bào)道基本一致，說(shuō)明模型構(gòu)建是成功的。嗜酸性粒細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的TGF β1，而TGF β1是哮喘氣道炎癥和重建的重要調(diào)控因子，可以促進(jìn)氣道纖維化及抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生〔2，6〕。我們的研究結(jié)果顯示：模型組中，TGF β1在間質(zhì)細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞及氣道黏膜上皮組織呈深棕色，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。

中醫(yī)學(xué)將支氣管哮喘歸屬于“哮病”的范疇。我們認(rèn)為哮喘反復(fù)發(fā)作為本虛標(biāo)實(shí)，下虛上實(shí)之癥，以陽(yáng)虛為本，痰瘀為標(biāo)。腎虛乃哮喘發(fā)病之根。痰瘀互結(jié)則構(gòu)成支氣管哮喘的重要病機(jī)。在臨床上運(yùn)用益腎活血平喘合劑治療哮喘反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的患者，取得較好的療效。方中補(bǔ)骨脂辛、溫，歸屬腎經(jīng)，溫腎壯陽(yáng)；生地苦、甘、寒，滋陰，二者共為君藥。川芎辛、溫，行氣活血；赤芍苦、微寒，活血涼血，與川芎協(xié)同作用，加強(qiáng)活血散瘀之功；炙麻黃，辛苦而溫，宣通肺氣，降逆平喘；杏仁苦、溫，善于除痰下氣，降利肺氣而平喘咳，與麻黃相配則宣降相因；穿山龍，通絡(luò)活血，化痰清肺；茯苓，化痰健脾，二者共為臣藥。炙甘草，補(bǔ)脾益氣化痰，作為佐使，調(diào)和諸藥。諸藥合用，益腎活血，宣肺平喘，健脾化痰。本研究證實(shí)益腎活血平喘方藥組大鼠氣道炎癥改變明顯輕于模型組；其氣道TGF β1的表達(dá)明顯低于模型組（P<0.01）及陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05），而TGF β1是哮喘氣道炎癥和重建的主要調(diào)控因子〔7〕，因此我們推測(cè)益腎活血平喘方藥可能通過(guò)抑制TGF β1的表達(dá)，從而減弱炎癥反應(yīng)及減少膠原的產(chǎn)生，防止氣道重塑的發(fā)生，為我們進(jìn)一步運(yùn)用益腎活血平喘方藥治療哮喘提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 李楊）

Effects of YiShenHuoXue Decoction on TGF β1Expression in Asthma Rats

ZHANG Yuanyuan1,2,ZHANG Yanping1,WANG Shucheng1,LING Jiayang1,FANG Maorong1
（1.Xi Yuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091,China; 2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the effects of Yishenhuoxuepingchuan（YSHXPC）decoction on TGF β1expression in airway of asthma rats.Methods:Sixty health female SD rats were randomly divided into 4 groups（15 in each）:the normal group（normal rats+saline）,the model group（athema rats+saline）,the positive control group（athema rats+hexadecadrol）,and the YSHXPC decoction treatment group（athema rats+YSHXPV decoction）.Each group was delivered aerosol inhalation of drug every day since the 14th day.Rats were sacrificed in the 28th day,pathological changes of lung observed by HE staining and TGF β1expression in lung tissue by immunohistochemical stain were conducted.Results:The results showed that the TGF β1expression was higher in normal group compared with other three groups.In YSHXPC decoction group,the TGF β1expression was reduced significantly compared with the model group and the positive control group.Conclusion:This research showed that YSHXPC decoction can effectively inhibit the TGF β1expression in experimental rats with asthma.

Yishenhuoxuepingchuan（YSHXPC）decoction;asthma;TGF β1

R256.12

A

1672-2345（2013）06-0031-03

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.009

2012-09-27

2012-11-16

張?jiān)?，高?jí)講師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)教學(xué)研究.