商宏偉，孫盛斌，肖穎彬，劉 梅

·基礎(chǔ)研究·

大鼠體外循環(huán)后血漿二胺氧化酶與小腸黏膜基質(zhì)蛋白變化的相關(guān)性研究

商宏偉，孫盛斌，肖穎彬，劉 梅

目的探討大鼠體外循環(huán)（CPB）后血漿二胺氧化酶活性與小腸黏膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白變化的相關(guān)性，為闡明CPB后腸黏膜屏障損害的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。方法健康成年雄性清潔級(jí)SD大鼠40只，隨機(jī)分為CPB組（n＝20）和假手術(shù)組（n＝20），另取10只作為正常對(duì)照組。應(yīng)用大鼠CPB模型進(jìn)行操作并于轉(zhuǎn)流結(jié)束后取血液標(biāo)本及小腸組織標(biāo)本，分光光度法測(cè)定血漿二胺氧化酶活性，免疫組化、放射免疫法和天狼星紅苦味酸染色法測(cè)定小腸組織層粘連蛋白、Ⅳ型膠原和間質(zhì)中Ⅰ、Ⅲ型膠原構(gòu)成及含量變化，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果CPB組血漿中二胺氧化酶活性比假手術(shù)組和正常對(duì)照組顯著增高（P＝0.018）；免疫組化顯示CPB組小腸組織中層粘連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)下降，出現(xiàn)上皮基底膜變薄，部分出現(xiàn)斷裂消失，含量明顯低于假手術(shù)組和正常對(duì)照組；CPB組小腸間質(zhì)中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原相間排列紊亂交錯(cuò)，Ⅰ型膠原減少明顯。圖像分析表明CPB組小腸組織膠原容積分?jǐn)?shù)明顯減少，而假手術(shù)和正常對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。線性回歸及相關(guān)分析結(jié)果CPB后小腸黏膜層粘連蛋白、Ⅳ型膠原含量、膠原容積分?jǐn)?shù)與血漿二胺氧化酶活性呈顯著的負(fù)相關(guān)。結(jié)論CPB后腸黏膜細(xì)胞外基質(zhì)各成分含量下降與結(jié)構(gòu)破壞是腸黏膜屏障功能損害的重要因素之一。

體外循環(huán)；大鼠；細(xì)胞外基質(zhì)；腸黏膜屏障

腸黏膜屏障是指腸道能夠阻止腸內(nèi)有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素等穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入人體其他組織、器官和血液循環(huán)的一種結(jié)構(gòu)和功能總和。正常的腸屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障共同構(gòu)成。已有研究表明體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）術(shù)后早期即可出現(xiàn)腸黏膜屏障功能的損害，是造成CPB后腸源性感染和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)（systemic inflammatory response，SIRS）發(fā)生發(fā)展的重要原因之一［1］。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）與上皮細(xì)胞相互作用是損傷后黏膜修復(fù)與重建的重要因素［2-3］，而CPB引起的腸黏膜細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致腸屏障功能受損腸源性感染的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。但是CPB后腸黏膜ECM變化及其在腸屏障功能中的作用還未確定。本研究旨在觀察CPB后腸黏膜上皮基底膜層粘連蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型膠原和間質(zhì)中Ⅰ、Ⅲ型膠原構(gòu)成及含量變化，探討其與腸屏障功能障礙的相關(guān)性，為闡明CPB后腸黏膜屏障損害的發(fā)生機(jī)制和探索CPB腸黏膜屏障保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠CPB模型［4-5］：

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性清潔級(jí)SD大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重350～500 g。術(shù)前6 h禁食水。

1.1.2 儀器設(shè)備 CPB滾壓式血泵（丹麥polystan A/S，Denmark），配套硅膠泵管內(nèi)徑4 mm。大鼠專用膜式氧合器（表面積0.10 m2）和熱交換器均由西安西京醫(yī)療器械公司定制；變溫水箱（Sarns，Ann Arbor，Michigan，美國(guó)）。轉(zhuǎn)流管道由硬塑料管組成、頸靜脈插管為18G一次性靜脈留置針（BD Intima-Ⅱintegrated catheter），平均動(dòng)脈壓（MAP）和動(dòng)脈灌注插管均為24G的一次性靜脈留置針。20 ml注射器作為靜脈貯血器。表式血壓計(jì)改裝后用于監(jiān)測(cè)MAP，連接管道以微量泵注射器延長(zhǎng)管代替，溫度計(jì)測(cè)定肛溫。氣管插管由8號(hào)嬰兒胃管代替；小動(dòng)物呼吸機(jī)為浙江大學(xué)醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。

1.1.3 預(yù)充 預(yù)充液總量25 ml，成分：新鮮的同種大鼠血液10～15 ml、血定安6 ml、乳酸林格氏液4 ml、5%碳酸氫鈉1 ml、20%甘露醇1 ml、肝素鈉300 IU/kg。

1.1.4 手術(shù)方法 術(shù)前30 min阿托品0.03 mg/kg皮下注射。10%烏拉坦溶液10 ml/kg腹腔注射麻醉，手術(shù)過(guò)程中根據(jù)情況追加。大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上。氣管切開(kāi)插管，呼吸機(jī)吸入氧濃度為21%，呼吸頻率60次/min，吸呼比為1∶2，潮氣量16～20 ml/kg。經(jīng)左側(cè)股動(dòng)脈插入24G留置針后接動(dòng)脈測(cè)壓表；再游離出左頸動(dòng)脈、頸靜脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎。經(jīng)過(guò)左股動(dòng)脈測(cè)壓管注射肝素鈉300 U/kg使全身肝素化。采用24G靜脈留置針經(jīng)左頸動(dòng)脈逆行插入作為動(dòng)脈灌注管；經(jīng)左頸靜脈將18G靜脈留置針穿刺直至右心房水平作為靜脈引流管。連接泵管后開(kāi)始轉(zhuǎn)流。轉(zhuǎn)流開(kāi)始時(shí)灌注流量約為35 ml/（kg· min），逐漸增加到約90～120 ml/（kg·min），平均流量為（85.0±12.5）ml/（kg·min）。轉(zhuǎn)流開(kāi)始后停止呼吸機(jī)輔助呼吸，氧合器供氧（FiO2為100%），氧流量與灌注流量比值保持在0.8～1.0。轉(zhuǎn)流過(guò)程中MAP保持在60～80 mm Hg。轉(zhuǎn)流穩(wěn)定后將肛溫逐漸降至約32.0℃，轉(zhuǎn)流60 min后逐漸復(fù)溫，直腸溫度達(dá)到約37.0℃后停止CPB。恢復(fù)機(jī)械通氣，待自主呼吸穩(wěn)定后撤離呼吸機(jī)。總轉(zhuǎn)流時(shí)間（75±9）min。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分為CPB組（n＝20）、假手術(shù)組（SH組，僅在各部位進(jìn)行插管操作，不轉(zhuǎn)流，n＝20）和正常組（N組，n＝10）。

1.3 標(biāo)本留取及處理 CPB結(jié)束后2 h處死動(dòng)物，無(wú)菌條件下取腸系膜上靜脈血分離血漿-70℃保存待測(cè)；取距回盲部5 cm的回腸腸段2 cm，按黎君友［6］方法進(jìn)行腸組織勻漿，-70℃保存；另取腸段2 cm，作病理分析。

1.4 指標(biāo)測(cè)定 按照黎君友等［6］建立的分光光度法測(cè)定血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性；由于CPB使用的血液稀釋對(duì)各指標(biāo)濃度的影響，用以下公式校正：校正值＝測(cè)定值×轉(zhuǎn)流前紅細(xì)胞比容（Hct）/測(cè)定時(shí)Hct。放射免疫法測(cè)定回腸組織勻漿中LN、Ⅳ型膠原含量，試劑盒購(gòu)自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所，按說(shuō)明書(shū)操作。免疫組化和天狼星紅苦味酸染色法分別進(jìn)行腸組織LN、Ⅳ型膠原和Ⅰ、Ⅲ型膠原染色，偏振光顯微鏡下可見(jiàn)Ⅰ型膠原呈紅黃色、Ⅲ型膠原呈綠色。采用DT2000型形態(tài)圖像分析軟件V2.0進(jìn)行拍照分析，計(jì)算小腸黏膜膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volumn fraction，CVF），CVF＝小腸黏膜膠原面積/所測(cè)術(shù)野總面積，所有標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野測(cè)量，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 血漿DAO活性變化 見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)DAO活性

2.2 小腸黏膜LN和Ⅳ型膠原變化 ①免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，CPB大鼠小腸黏膜中層LN和Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)下降，上皮基底膜變薄，部分?jǐn)嗔严?，?jiàn)圖2、3。②定量分析：放射免疫結(jié)果顯示大鼠小腸黏膜組織勻漿中層LN和Ⅳ型膠原含量在CPB后明顯下降，顯著低于假手術(shù)組和正常對(duì)照組，見(jiàn)圖4。

2.3 小腸黏膜Ⅰ、Ⅲ型膠原含量變化 天狼星紅苦味酸染色偏振光顯微鏡下膠原定性結(jié)果顯示：正常對(duì)照組和假手術(shù)組小腸黏膜染色和間質(zhì)性細(xì)胞外間質(zhì)中Ⅰ型膠原（紅黃色）、Ⅲ型膠原（綠色）相間排列整齊，含量豐富，呈條索狀；CPB組可見(jiàn)條索狀的染色明顯減少，排列紊亂交錯(cuò)，紅黃色的Ⅰ型膠原減少明顯，見(jiàn)圖5。

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，CPB組小腸組織小腸黏膜膠原容積分?jǐn)?shù)明顯減少，而假手術(shù)組和正常對(duì)照組之間無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖6。

2.4 小腸黏膜ECM變化與血漿DAO活性的相關(guān)性線性回歸及相關(guān)分析結(jié)果CPB后小腸黏膜層粘連蛋白、Ⅳ型膠原含量、小腸黏膜膠原容積分?jǐn)?shù)與血漿DAO活性呈顯著負(fù)相關(guān)。見(jiàn)圖7。

圖2 小腸黏膜組織層粘連蛋白表達(dá)（×200）

圖3 小腸黏膜Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)（×200）

圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)LN和Ⅳ型膠原含量定量分析

圖5 實(shí)驗(yàn)結(jié)束小腸黏膜天狼星紅染色（×200）

圖6 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小腸黏膜CVF

圖7 腸黏膜LN、Ⅳ型膠原含量、CVF與血漿DAO活性關(guān)系

3 討 論

CPB過(guò)程中血液重新分布，以大腦為代表的主要臟器血流基本不變，而腹腔臟器血流驟然減少，加上CPB過(guò)程的血液稀釋，腸道處于低氧、低壓、低灌注狀態(tài)。CPB時(shí)腸道屏障功能易受到破壞與腸道特有的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，由于特殊的血管解剖學(xué)和“逆流交換機(jī)制”（countercurrent exchange mechanism），即小動(dòng)脈以直角方式進(jìn)入絨毛，邊擴(kuò)散氧邊走行至絨毛尖部，造成絨毛尖部氧分壓低于基底部。在小腸血流減少時(shí)逆流交換機(jī)制亢進(jìn)，從而使黏膜遭受缺血打擊，而腸絨毛頂部是對(duì)局部缺氧最敏感最易受打擊的部位。研究發(fā)現(xiàn)CPB引起腸黏膜損傷的組織學(xué)特征是小腸部分絨毛水腫、片狀壞死、脫落，固有層血管充血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、柱狀上皮壞死，部分絨毛斷裂、脫落，結(jié)果表明CPB后腸上皮細(xì)胞完整性和細(xì)胞骨架發(fā)生改變，是造成腸屏障功能變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，并證實(shí)腸上皮細(xì)胞凋亡在CPB后腸屏障功能損害中起重要作用［2，5，7-8］。但是對(duì)于小腸黏膜ECM成分變化在屏障功能障礙發(fā)生中作用的研究鮮有報(bào)道。

DAO是所有哺乳動(dòng)物腸黏膜上皮絨毛細(xì)胞胞漿中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶。DAO不但能夠反映腸黏膜完整性和損傷程度，而且能通過(guò)無(wú)創(chuàng)性測(cè)定外周血中DAO活性變化來(lái)反映腸黏膜狀態(tài)，是反映小腸黏膜機(jī)械屏障的完整性和損傷程度較為理想的指標(biāo)［1，7，9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CPB組血漿DAO活性明顯升高，提示CPB后腸黏膜完整性破壞，腸屏障功能已經(jīng)受損。

腸黏膜上皮細(xì)胞基底面與深部結(jié)締組織之間共同形成的薄膜稱為基底膜，構(gòu)成基底膜的主要成分是LN、Ⅳ型膠原和硫酸肝素蛋白多糖等?；啄は旅媸情g質(zhì)性ECM，富含有Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖維LN和多種糖蛋白等。生理狀態(tài)下基底膜除了具有支持、連接和固著作用外，還有利于上皮細(xì)胞與深部組織間的物質(zhì)交換。新近研究表明基底膜還可以引導(dǎo)上皮細(xì)胞移動(dòng)，影響細(xì)胞的增殖和分化。腸黏膜屏障的重要基礎(chǔ)是腸上皮細(xì)胞和基底膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性和穩(wěn)定性。腸黏膜ECM與上皮細(xì)胞之間的相互作用是損傷后黏膜修復(fù)的重要因素［1］。有關(guān)ECM對(duì)于腸屏障功能的影響可以從以下方面考慮：①ECM成分參與細(xì)胞的連接、信號(hào)傳遞，是細(xì)胞賴以生存的重要基礎(chǔ)［1，9-10］；②間質(zhì)性ECM成分Ⅰ、Ⅲ型膠原含量變化可使得腸黏膜正常形態(tài)發(fā)生變化，如腸絨毛內(nèi)微血管、乳糜管和各種纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起功能障礙，而不是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的途徑造成屏障功能的損害。

本研究表明CPB后大鼠小腸黏膜上皮基底膜LN和Ⅳ型膠原表達(dá)明顯減少，基底膜出現(xiàn)變薄、斷裂或缺如。間質(zhì)性ECM中Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解增加，含量下降。CPB后小腸黏膜LN、Ⅳ型膠原含量、CVF與血漿DAO活性呈顯著的負(fù)相關(guān)。其中LN和Ⅳ型膠原含量與血漿DAO活性相關(guān)性更顯著，提示CPB后腸黏膜ECM各成分含量下降與結(jié)構(gòu)破壞是腸屏障功能損害的重要因素之一。術(shù)后監(jiān)測(cè)血漿DAO活性對(duì)于腸黏膜功能監(jiān)測(cè)和保護(hù)有重要意義。

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Study on the correlation between plasma diamine oxidase activity and the changes of extracellular matrix of intestinal mucosa in rats after cardiopulmonary bypass

Shang Hong-wei，Sun Sheng-bin，Xiao Ying-bin，Liu Mei
Department of Cardiothoracic Surgery，PLA 254 Hospital，Tianjin 300142，China

ObjectiveTo study the correlation between plasma diamine oxidase activity and the changes of extracellular matrix（ECM）of intestinal mucosa in rats after cardiopulmonary bypass（CPB）.MethodsCPB model in rats was established.40 SD rats were randomly divided into CPB group（n＝20）and sham-operation（SH）group（n＝20），another 10 SD rats were taken as normal control（N）group.The plasma diamine oxidase（DAO）activity was measured by spectrophotometry，and the ECM component laminin（LN）and typeⅠ，Ⅲ，Ⅳcollagens of intestinal mucosa were measured by immunohistochemsitry，radioimmunology and picrosirus red stained respectively.ResultsThe plasma DAO activity in group CPB（1.817±0.359 U/ml）was significantly higher than those in group SH and N（P＝0.018），while the contents of intestinal mucosa of LN and typeⅣcollagen in group CPB were obviously decreased compared with those in group N and SH.It showed that the epithelial basement membrane of intestinal mucosa became thinner，partly ruptured and even disappeared by immunohistochemistry in group CPB.Type I and III collagens arranged interphasely but in disorder in group CPB，especially the type I collagen was significantly decreased.The collagen volume fraction（CVF）was significantly decreased in group CPB compared with group SH and N，but there is no difference between group SH and N.The changes of LN and typeⅠ，Ⅲ，Ⅳcollagens in the intestinal mucosa in group CPB were significantly negatively correlated with the activity of plasma DAO by linear correlative analysis.ConclusionThe contents decrease of the components of ECM and the disorganization in intestinal mucosa were the important factors of intestinal barrier dysfunction after cardiopulmonary.

Cardiopulmonary bypass；Rats；Extracellular matrix（ECM）；Intestinal barrier

R654.1

A

1672-1403（2013）02-0111-05

2012-10-23）

2013-02-17）

300142天津，解放軍第254醫(yī)院心胸外科（商宏偉、孫盛斌）；400037重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院心血管外科（肖穎彬、劉 梅）