張 薇，張?jiān)?，?灝，余 龍

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所，上海 200433）

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率已超過100萬／年，我國(guó)一直是世界范圍內(nèi)肝癌高發(fā)區(qū)，我國(guó)的肝癌死亡率位于癌癥死亡率的第二位.發(fā)病率約為歐美國(guó)家的10倍［1］.肝癌因其惡性程度高，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，病情進(jìn)展快，以及缺乏有效的早期診斷方法，大部分患者就診時(shí)已為晚期.肝癌是先天耐藥的癌癥，細(xì)胞毒化療藥物對(duì)晚期肝癌療效差，治療技術(shù)有限，有效治療尚無標(biāo)準(zhǔn)方案［2］.因此肝癌致病基因以及致病機(jī)理的研究對(duì)于肝癌的病理診斷和針對(duì)肝癌特異靶點(diǎn)的藥物研發(fā)尤為重要.

蛋白激酶CK2最初發(fā)現(xiàn)于1954年，曾經(jīng)被稱為酪蛋白激酶Ⅱ，是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲／蘇氨酸蛋白激酶，高度保守且功能多樣［3-6］.在細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖，凋亡以及生物節(jié)律的調(diào)控中均發(fā)揮重要的作用.CK2是一類酶家族，由兩類催化亞基（α和α'）和一類調(diào)節(jié)亞基（β）構(gòu)成.CK2可以以全酶的形式存在，形成異源四聚體（α2β2；α'2β2；αα'β2），各個(gè)亞基也可能以游離的狀態(tài)存在［7］.CK2是一種具有底物水平磷酸化能力的蛋白激酶，有多種底物，這些底物涉及細(xì)胞功能的許多方面，如DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，RNA加工與翻譯，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與加工，癌基因與抑癌基因活性的調(diào)節(jié)等［8，9］.

目前的研究表明CK2不僅對(duì)于細(xì)胞的存活和正常的生理功能的行使必不可少，而且與眾多疾病，特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在迄今為止已檢測(cè)過的腫瘤中，CK2均表達(dá)失調(diào).CK2激酶活性的增高可能與腫瘤細(xì)胞的分化程度及侵襲轉(zhuǎn)移等有關(guān).如Pallares等在研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸癌中CK2的激酶活性的增高與腫瘤的分級(jí)分期密切相關(guān)［10］.一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，CK2的表達(dá)失衡導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)致癌潛能被激發(fā).如CK2聯(lián)合C－Myc的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以顯著增加小鼠患淋巴瘤和白血病的幾率.這些研究表明，CK2參與腫瘤的發(fā)生可能與其對(duì)細(xì)胞中其他致癌信號(hào)的調(diào)控有關(guān)［11］.因此CK2已經(jīng)成為一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)，不同作用模式的CK2抑制劑相繼誕生，根據(jù)其作用模式的不同，可以分為ATP競(jìng)爭(zhēng)性和非ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，后者又包括底物靶向抑制劑，CK2α亞基外部靶向抑制劑及阻斷亞基相互作用抑制劑［12］.

CK2的β亞基，是催化亞基α或α'的特異配體，對(duì)全酶活性及穩(wěn)定性起調(diào)節(jié)作用.其N端（5～104AA）組成的α螺旋酸性環(huán)區(qū)通過與α亞基的賴氨酸富含區(qū)相互作用，調(diào)節(jié)CK2的激酶活性，控制其對(duì)底物的磷酸化.與催化亞基具有多種異構(gòu)體不同的是，目前在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)亞基CK2β只發(fā)現(xiàn)了一種，由215個(gè)氨基酸殘基組成，在種屬間具有高度保守性（如人與果蠅之間可達(dá)88%同源性），這提示CK2β是CK2細(xì)胞功能重要介導(dǎo)劑［12，13］.過去曾認(rèn)為CK2β只存在于全酶中，對(duì)催化亞基起靶向調(diào)節(jié)作用，因此以往的研究多針對(duì)CK2α催化亞基，特別是以其作為抑制CK2激酶活性并作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)，而往往忽視了調(diào)節(jié)亞基CK2β的功能.然而，現(xiàn)在越來越多的資料表明，CK2β?lián)碛械莫?dú)立于CK2激酶的功能，具有更為重要和廣泛的調(diào)節(jié)作用，它通過與c－Mos，Chk1，A－Raf等激酶直接互作調(diào)節(jié)其激酶活性，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能［14-17］.如Martel等人用特異性小肽靶向CK2β，可增加P53蛋白量，通過P53途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］.也有文獻(xiàn)顯示，在非小細(xì)胞肺癌中，CK2β的表達(dá)明顯上升，特異性靶向CK2β的siRNA可下調(diào)CK2β的蛋白表達(dá)，提示CK2β亞基可能作為一有效的抗癌藥物篩選的分子靶點(diǎn)［19，20］.此外，小鼠和秀麗隱桿線蟲CK2β缺失是致死型突變［21］，說明其在細(xì)胞生存中起著舉足輕重的作用.

報(bào)道顯示，CK2β在腫瘤中的表達(dá)變化僅在頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌等中有報(bào)道［22-25］，其在腫瘤中的功能也缺少深入的研究.本文擬研究CK2β在肝癌中的表達(dá)變化及功能，考察CK2β在肝癌中的表達(dá)變化及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響.此外，還將研究消減CK2β表達(dá)能否提高肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，對(duì)siRNA消減靶向CK2β與現(xiàn)有化療藥物聯(lián)合使用進(jìn)行了初步探討.

1 材料與方法

1.1 材料

91例原發(fā)性肝癌及癌旁組織cDNA樣品來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院.75例原發(fā)性肝癌與癌旁組織樣品購自上海芯超生物科技有限公司，所有診斷均經(jīng)病理切片證實(shí)，染色強(qiáng)度評(píng)分由病理科醫(yī)生獨(dú)立完成.

1.2 細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染

采用SMMC－7721肝癌細(xì)胞均勻接種，使其16h后達(dá)40%～50%匯合度.將4μL Lipofectamin2000與100μL DMEM混合孵育，siRNA片段與100μL DMEM混合孵育，靜置15min.將已貼壁的細(xì)胞用PBS清洗一遍，更換無血清DMEM培養(yǎng)基，45min后將轉(zhuǎn)染混合物均勻滴加，使得siRNA的終濃度達(dá)到10～20nmol／L.4h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).CK2β的敲減siRNA片段序列為（上海吉瑪生物公司）：SiRNA－1：sense5'－3'CGCUACAUCCUUACCAACCGU，Antisense5'－3'ACGGUUGGUAAGGAU GUAGCG；SiRNA－2：sense5'－3'CUUUGGUUACUGUCCUCUUGU，Antisense5'－3'ACACGAGGACA GUAACCAA；siRNA－Ns：sense5'－3'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，Antisense 5'－3'ACGUGAC ACGUUCUCATAA.

1.3 Real－time PCR

按照TOYOBO公司SYBR Green Supermix試劑盒說明書操作.利用溫度梯度PCR摸索適合CK2β實(shí)時(shí)PCR引物的退火溫度.退火溫度60℃，35個(gè)循環(huán).4復(fù)孔，以β2－MG作為內(nèi)參基因，基因的表達(dá)量用相對(duì)定量的方法進(jìn)行比較.引物序列（上海生物工程公司）CK2β－F：GTCCTGGATTTCCTGGTTC TGTG；CK2β－R：CTGCTCAATCAGGTCACTCTGG.

1.4 Western blot

配置SDS－PAGE分離膠和濃縮膠，用SDS上樣緩沖液充分裂解細(xì)胞，收集裂解液，100℃水浴變性8min.室溫100V電壓下進(jìn)行電泳.卸膠，轉(zhuǎn)移緩沖液平衡凝膠和硝酸纖維素膜20min.4℃濕轉(zhuǎn)法100V 2h，脫脂牛奶室溫封閉1h.封閉緩沖液稀釋一抗，室溫下孵育2h或4℃搖床過夜.將膜浸泡在TBST洗滌緩沖液中，漂洗10min，重復(fù)3遍.封閉緩沖液中稀釋二抗（1∶5000～1∶10000），室溫下?lián)u床孵育1h，洗膜3次.用ECL法進(jìn)行顯色.抗體來源：β－actin單克隆抗體（Sigma公司）；抗人CK2βmonoclonal antibody（Epitomics公司）.

1.5 免疫組化檢測(cè)CK2β在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)

將組織芯片放入全自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行脫蠟；用純水沖洗3次，1次1min.放入阻斷劑中15min；用PBS緩沖液沖洗3次；一抗放入離心機(jī)中7200r／min離心30s，按照1∶50稀釋度用DAKO抗體稀釋液稀釋；滴加一抗，放入4℃冰箱過夜孵育；室溫放置30～45min；將片子用PBS緩沖液沖洗3次；滴加DAKO公司的EnVisionTM＋／HRP兔工作液，孵育30min；時(shí)間到后用PBS沖洗3次，1次1min；在片子上滴加稀釋后的DAB，顯色5min，到時(shí)后自來水沖洗5min；在片子上滴加哈氏蘇木素（Sigma公司）40s，用自來水沖洗2min；將片子放入全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行脫水，取出封片.鏡檢拍照.

1.6 MTS法測(cè)定消減細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞種于6孔板中，至40%～50%匯合度時(shí)，按細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染.24h后，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于96孔板中（2×103／孔）.每24h，每孔加入10μL MTS／DMEM混合液，繼續(xù)培養(yǎng)3h后顯色，連續(xù)檢測(cè)6d.以沒有任何細(xì)胞的無血清DMEM為對(duì)照.檢測(cè)前搖晃培養(yǎng)板8s，混勻.用BioTek H4酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450nm時(shí)各孔的光吸收值.

本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于NIPPV單用，納洛酮聯(lián)用NIPPV能顯著增加PO2水平和降低PCO2水平，增加SaO2水平，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明納洛酮聯(lián)用NIPPV能顯著糾正機(jī)體酸堿平衡，糾正低氧血癥；其次，住院死亡率和再次有創(chuàng)氣管插管率顯著降低，說明納洛酮能顯著降低NIPPV治療失敗率，同時(shí)顯著減少住院時(shí)間，有利于減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。用藥期間未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，患者耐受性好，說明納洛酮聯(lián)用NIPPV安全性較好。

1.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

細(xì)胞接種和饑餓：首先在35mm的皿底端做好標(biāo)記，將細(xì)胞分為不同的區(qū)域.將目的細(xì)胞按每孔約1.5×106個(gè)細(xì)胞接種，貼壁后細(xì)胞密度約為100%的匯合度時(shí)，用PBS漂洗細(xì)胞2遍，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng).

細(xì)胞劃痕：細(xì)胞饑餓24h后，用20μL的槍頭在鋪滿細(xì)胞的皿中劃一條痕跡，然后用PBS洗2遍，洗去細(xì)胞碎片.Leica DM RA2顯微鏡鏡檢：取不同時(shí)間點(diǎn)用倒置顯微鏡拍攝細(xì)胞相同位置的遷移情況.

2 結(jié) 果

2.1 CK2β在肝癌組織mRNA水平顯著上調(diào)表達(dá)及其與肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)分析

用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)了91對(duì)肝癌和癌旁標(biāo)本中CK2β的mRNA水平.采用△△Ct值法，試驗(yàn)中以β2－MG基因作為內(nèi)參基因，計(jì)算每對(duì)樣本中癌組織的CK2β的mRNA與β2－MG的mRNA的相對(duì)表達(dá)量之比（T／N），對(duì)相對(duì)表達(dá)量取log2值作圖（圖1）.分析時(shí)，顯著性差異的閾值設(shè)定為±1.分析時(shí)，正一為上調(diào)一倍，負(fù)一為下調(diào)50%.在69對(duì)樣品（75.8%）中，CK2β在癌組織中呈現(xiàn)顯著性上調(diào)，在8對(duì)樣本（8.79%）中差異不明顯，20對(duì)樣本（21.98%）中呈現(xiàn)顯著性下調(diào).

圖1 CK2βmRNA水平在肝癌組織中顯著性上調(diào)Fig.1 The high expression of gene CK2βmRNA level in HCC

為了觀察CK2β的表達(dá)變化是否對(duì)臨床診斷和治療具有指導(dǎo)性意義，我們將91對(duì)肝癌樣本中CK2β的mRNA變化數(shù)據(jù)與臨床病理特征進(jìn)行了相關(guān)性分析（表1（見第250頁））.盡管在AFP（Alphafetoprotein），病理分化程度（Pathological differentiation），腫瘤包膜（Tumor encapsulation），肝硬化結(jié)節(jié)（Hepatic cirrhotic nodule），癌栓（Portal vein tumor thromb）等指標(biāo)中沒有觀察到相關(guān)性，但是發(fā)現(xiàn)CK2β的表達(dá)變化與臨床分期（TNM clinical stage）具有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)得出的P值為0.02.這一結(jié)果表明，CK2β的上調(diào)表達(dá)可能參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展.

表1 CK2βmRNA水平在HCC中的表達(dá)與病理資料相關(guān)性分析Tab.1 The correlation between CK2βmRNA expression and clinical pathological data

2.2 CK2β在肝癌組織中的分布和表達(dá)情況及其與臨床病理資料的相關(guān)性分析

對(duì)75對(duì)肝癌組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，將CK2β的多克隆抗體以1∶50比例稀釋，檢測(cè)結(jié)果如下圖所示（圖2）.隨后對(duì)75對(duì)樣本染色強(qiáng)弱進(jìn)行了分級(jí)，0、＋、＋＋、＋＋＋分別代表染色強(qiáng)度弱、中等、強(qiáng)、較強(qiáng).經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析：在肝癌和癌旁組織中，CK2β在細(xì)胞核與細(xì)胞漿中均有表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度有所不同，CK2β在肝癌組織較之癌旁組織總體表達(dá)強(qiáng)度顯著增高（P＜0.01）（表2）.這提示我們CK2β的表達(dá)強(qiáng)度的增高與肝癌的發(fā)生發(fā)展有顯著性的關(guān)系.

圖2 CK2β在癌及癌旁中免疫組化檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The expression of CK2βby immunefluorescent

表2 75對(duì)肝癌及癌旁DAB染色分級(jí)統(tǒng)計(jì)分析表Tab.2 The analysis result of DAB staining of 75HCC cancer and adjacent cancer tissues

為了觀察CK2β的表達(dá)變化是否對(duì)于臨床診斷和治療具有指導(dǎo)意義，我們將75對(duì)肝癌樣品中CK2β的免疫組化染色強(qiáng)度與臨床病例資料進(jìn)行了相關(guān)性分析（表3）.對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的染色強(qiáng)度分析得出：CK2β的表達(dá)與年齡（Age），是否小肝癌（Small hepatocellular carcinoma），病理分化程度具有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)計(jì)算其P值分別為：0.02、0.03、0.01.其中與病理分化程度高度顯著相關(guān).對(duì)細(xì)胞漿內(nèi)的染色強(qiáng)度分析得出：CK2β的表達(dá)與是否結(jié)節(jié)（Hepatic cirrhotic nodule）病理分化程度有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)計(jì)算其P值分別為：0.02、0.04.結(jié)果顯示無論在胞核染色還是胞漿染色中，CK2β的表達(dá)和病理分化程度均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性.

表3 CK2β染色強(qiáng)度與病理資料相關(guān)性分析Tab.3 The correlation between CK2βstaining degree and clinical pathological data

2.3 siRNA消減CK2β基因表達(dá)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)

經(jīng)siRNA小片段轉(zhuǎn)染SMMC－7721細(xì)胞后，48h收集蛋白裂解液樣.敲減內(nèi)源CK2β的細(xì)胞裂解樣品經(jīng)檢測(cè)后，在敲減片段作用下雜交條帶強(qiáng)度與對(duì)照組相比，蛋白表達(dá)不同程度的減弱，結(jié)果顯示該抗體能夠準(zhǔn)確識(shí)別該目的基因.因此從蛋白水平證實(shí)了敲減片段的有效性，細(xì)胞中的CK2β蛋白的表達(dá)被有效的抑制（圖3（a））.

為了觀察CK2β基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)的影響，用經(jīng)過有效性驗(yàn)證的CK2β的siRNA小片段轉(zhuǎn)染SMMC－7721細(xì)胞.MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3（b）顯示，經(jīng)過6天的連續(xù)檢測(cè)，敲減掉內(nèi)源的CK2β后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢.與對(duì)照轉(zhuǎn)染Ns小片段的實(shí)驗(yàn)組和未轉(zhuǎn)任何片段的non實(shí)驗(yàn)組相比，細(xì)胞從第4～5天起，增殖情況出現(xiàn)顯著性差異，生長(zhǎng)減緩（P＜0.01）.

克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖3－（c）），將SMMC－7721細(xì)胞接種于6孔板中，貼壁后，至40%～50%匯合度時(shí)，轉(zhuǎn)染CK2β敲減siRNA片段1#2#，每組均種有3復(fù)孔.Control組為未轉(zhuǎn)入任何片段組，Ns組為轉(zhuǎn)入nonsilence片段的對(duì)照組.24h后，消化細(xì)胞，并計(jì)數(shù).于6孔板中每孔種入1000個(gè)細(xì)胞.37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2周，期間每3天更換1次新鮮培養(yǎng)基.2周后結(jié)晶紫染色顯示克隆的形成情況.瞬時(shí)敲減掉CK2β基因的克隆形成的大小和密度明顯減小，克隆個(gè)數(shù)減少.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲CK2β除后能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞中克隆的形成.

圖3 消減CK2β表達(dá)后對(duì)細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect on cell growth when downregulate the expression of CK2β

2.4 敲減CK2β表達(dá)減弱細(xì)胞株的遷移和侵襲能力

為研究CK2β對(duì)于細(xì)胞株遷移能力的影響，在SMMC－7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA小片段24h后，消化細(xì)胞計(jì)數(shù)并種板，使細(xì)胞達(dá)到100%匯合度.細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞，24h后劃痕，分別在0，24，48，72h時(shí)顯微鏡10倍鏡下觀察同一區(qū)域并拍照.如下圖所示：NS為對(duì)照轉(zhuǎn)染non－silence片段組，I1為轉(zhuǎn)染1#敲減小片段實(shí)驗(yàn)組.結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組敲減掉CK2β，在48h后遷移的面積明顯小于對(duì)照組（圖4）.細(xì)胞遷移區(qū)域有顯著性差異，細(xì)胞遷移速度減慢.

2.5 消減CK2β表達(dá)豐度能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性

CK2β在肝癌組織中明顯的上調(diào)表達(dá)，并且能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，因此可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用.那么消減CK2β是否能夠增加肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，是否可能成為某種抗腫瘤藥物或聯(lián)合用藥的潛在藥物靶點(diǎn)？

用臨床上常用的10種抗腫瘤藥，將實(shí)驗(yàn)組分為四組：A轉(zhuǎn)染non－silence片段，不加藥；B轉(zhuǎn)染nonsilence片段，加藥；C轉(zhuǎn)染CK2β消減siRNA片段，加藥；D轉(zhuǎn)染CK2β消減siRNA小片段，不加藥組.48 h后用MTS方法檢測(cè).細(xì)胞相對(duì)存活率用后3組的數(shù)據(jù)除以對(duì)照組A組數(shù)據(jù)的平均數(shù)來計(jì)算.t－test結(jié)果顯示（圖5）：相對(duì)于其他3組對(duì)照組，消減CK2β能夠增強(qiáng)SMMC－7721細(xì)胞對(duì)于喜樹堿，長(zhǎng)春新堿，阿霉素和柔紅霉素的敏感性.

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.4 The cell erasion trace test result

圖5 10種抗腫瘤藥物作用下細(xì)胞生存率效果圖Fig.5 The cell viability after the treatment of 10different anti－cancer drugs

3 討 論

目前對(duì)于CK2在腫瘤中的作用已有深入的研究.CK2的表達(dá)水平與活性的明顯增高，不僅與腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散能力，癌癥預(yù)后相關(guān)，還反映其病理生理學(xué)特征.

蛋白激酶CK2一直被認(rèn)為是治療腫瘤的一個(gè)具有潛力的分子靶點(diǎn)，目前已知的小分子抑制劑主要包括活性肽，鹵代化合物TBB衍生物，多酚衍生物，以及以吲哚喹啉為基礎(chǔ)的衍生物.其中CK2抑制劑CX4945已進(jìn)入Ⅰ期臨床，開始面向晚期實(shí)體瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者.這些靶向CK2激酶的藥物研究主要是設(shè)計(jì)針對(duì)CK2催化亞基的小分子抑制劑［26］.由于長(zhǎng)久以來研究者僅認(rèn)識(shí)到CK2β存在于全酶中對(duì)催化亞基起靶向調(diào)節(jié)作用的功能，忽視了其獨(dú)立于該復(fù)合物的功能，因而CK2β的研究一直比較粗淺，特別是缺少其在腫瘤中的功能性研究.近年來現(xiàn)在越來越多的研究開始關(guān)注CK2β獨(dú)立于CK2激酶的功能，揭示了其更為重要和廣泛的調(diào)節(jié)作用，它通過與c－Mos、Chk1、A－Raf等激酶直接互作調(diào)節(jié)其激酶活性，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能［7-10］.

對(duì)于CK2β在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸引起研究者的重視.在血液系統(tǒng)腫瘤中：具有正常核型的急性髓細(xì)胞樣白血病患者中，CK2抑制劑的敏感性與CK2β基因的表達(dá)水平密切負(fù)相關(guān)；慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的存活方面，抑制CK2β基因表達(dá)影響白血病細(xì)胞的存活率.在實(shí)體腫瘤中：Laramas等人的研究顯示，男性前列腺癌中，針對(duì)CK2β的小干擾RNA能夠特異性抑制前列腺細(xì)胞而對(duì)良性細(xì)胞沒有作用.女性子宮內(nèi)膜癌中CK2β的表達(dá)率和強(qiáng)度都明顯升高，利用短發(fā)夾RNA（shRNA）下調(diào)CK2β，癌細(xì)胞的集落形成受阻.在宮頸癌，乳腺癌，頭頸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，結(jié)直腸癌中通過抑制CK2β的表達(dá)，都不同程度抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［27，28］，發(fā)揮重要功能.

CK2β在肝癌中的表達(dá)變化和功能研究尚屬空白.本研究首先91對(duì)肝癌樣本的CK2β的mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CK2β較癌旁組織顯著性上調(diào)表達(dá).對(duì)75對(duì)組織標(biāo)本的免疫組化檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，較癌旁組織，CK2β蛋白水平表達(dá)明顯上升，分析顯示有顯著性差異（P＜0.01），胞漿和胞核中均顯著性上調(diào)表達(dá).這提示：CK2β可能在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中行使一定的功能.

隨后合成了針對(duì)CK2β的敲減小片段，從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證了其具有明顯的消減效果.瞬時(shí)消減SMMC－7721細(xì)胞內(nèi)源的CK2β蛋白，經(jīng)過MTS檢測(cè)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率顯著性減慢.克隆形成的實(shí)驗(yàn)也相互佐證了該結(jié)果，在敲減掉CK2β的細(xì)胞株中，克隆形成的大小和個(gè)數(shù)有顯著性差異，細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成減慢.在劃痕實(shí)驗(yàn)中，瞬時(shí)消減SMMC－7721細(xì)胞內(nèi)源的CK2β蛋白表達(dá)，48h及72h后開始可以觀察到顯著性差異，細(xì)胞遷移的速度減慢.這些都提示：CK2β與肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力有關(guān).這些結(jié)果表明，CK2β在肝癌中顯著上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量與臨床分期呈正相關(guān)，提示其可能作為輔助肝癌診斷的分子marker.瞬時(shí)消減細(xì)胞內(nèi)源的CK2β表達(dá)可以有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，提示CK2β是肝癌細(xì)胞快速增殖和遷移所必需的.將進(jìn)一步在裸鼠成瘤動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)對(duì)瘤體生長(zhǎng)的影響.

本研究還就CK2β在肝癌中能否影響抗腫瘤藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性做了初步的探討.發(fā)現(xiàn)CK2β的下調(diào)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素，柔紅霉素，喜樹堿，長(zhǎng)春新堿的敏感性.因喜樹堿等藥物通過參與DNA的損傷來發(fā)揮抑制腫瘤作用，而CK2β亦影響DNA的損傷與修復(fù).因此猜測(cè)可能發(fā)揮協(xié)同的效應(yīng).但分子機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明.長(zhǎng)期以來，由于肝癌的治療沒有很有效的治療藥物，采用手術(shù)的切除率還不到15%，抗肝癌治療至今處于技術(shù)有限，有效藥物很少的困難境地.諾拉曲特（Nolatrexed）是目前唯一針對(duì)肝癌的處于三期臨床研究階段的化合物.因此開發(fā)有效的化療藥物應(yīng)用于肝癌的治療非常必要.由于傳統(tǒng)的化療藥物如阿霉素，5－FU反應(yīng)率低，選擇性差，毒副作用較大，而用紫杉醇，氟達(dá)拉賓等藥物進(jìn)行全身化療時(shí)的反應(yīng)率幾乎為零［1］.因此尋找肝癌特異性的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前肝癌化療藥物開發(fā)的熱點(diǎn)和難點(diǎn).本研究不僅提示了CK2β作為新的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的可能，并且為通過聯(lián)合用藥提高現(xiàn)有抗腫瘤藥物藥效的腫瘤治療思路提供了新的線索.

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