劉 林，楊少宗，林師冠，王曉輝，孔垂瑾，曲喜英，朱煥章

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；（2.河南 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，洛陽 471001）

獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immuno Deficiency Syndrome，AIDS）病人體內(nèi)HIV－1潛伏感染細(xì)胞的存在，是造成病人在高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（Highly Active Antiretroviral Therapy，HAART）治療中止后外周血中病毒拷貝數(shù)重新反彈的主要原因［1，2］.在這個(gè)病毒儲(chǔ)藏庫中，HIV－1整合在宿主細(xì)胞基因組中但病毒基因并不表達(dá)，使得該細(xì)胞與正常細(xì)胞并無區(qū)別從而逃避免疫系統(tǒng)的清除作用［3］.當(dāng)這些潛伏細(xì)胞受到細(xì)胞因子等刺激而活化后，病毒基因就能得以激活并產(chǎn)生新的病毒，從而使血液中病毒拷貝數(shù)反彈［4］.

目前一種新型的“激活 清除”治療策略，就試圖通過特定的激活劑來激活潛伏病毒，并輔以HAART 治療來阻止新產(chǎn)生病毒的傳播，最終利用免疫系統(tǒng)的作用來清除潛伏感染細(xì)胞［5，6］.由于在感染HIV－1的病人體內(nèi)，每106個(gè)靜止CD4＋T細(xì)胞中才有一個(gè)整合有復(fù)制完全型的HIV－1，這意味著一個(gè)病人體內(nèi)的潛伏感染的細(xì)胞數(shù)不會(huì)超過107［7］.因此，建立有效的用于藥物篩選的模型，是成功篩選高效、低毒性HIV潛伏激活劑的一個(gè)關(guān)鍵.

HIV－1基因表達(dá)極其依賴于宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子［8］.造成HIV－1潛伏感染的一個(gè)重要分子機(jī)制就是轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的缺乏［9］.在HIV－1潛伏感染的建立和再激活中，NF－κB和Tat扮演了至關(guān)重要的角色［4，8］.靜止記憶CD4＋T淋巴細(xì)胞核中缺乏活化的NF－κB，是這些淋巴細(xì)胞中促使HIV－1原病毒潛伏的關(guān)鍵因素［10］.Tat蛋白是HIV－1基因正常轉(zhuǎn)錄所必需的，缺少了Tat的作用會(huì)導(dǎo)致病毒基因不能夠正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)而促使病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)潛伏［8］.在這過程中，NF－κB和Tat通過分別結(jié)合到HIV－1 LTR中κB和TAR元件上發(fā)揮作用.因此，本文旨在構(gòu)建野生型及κB或TAR元件突變型HIV－1LTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染人腎表皮細(xì)胞293，通過G418篩選以獲得熒光素酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆.由于TNF－α是一種有效的激活HIV－1表達(dá)的激活劑，它能夠特異性激活下游NF－κB信號(hào)通路［9］，可以用來研究這些細(xì)胞模型對(duì)于TNF－α的反應(yīng)是否符合預(yù)期.我們進(jìn)一步用激活劑TNF－α對(duì)該體外系統(tǒng)進(jìn)行處理，以初步探討模型在篩選HIV－1潛伏激活藥物及信號(hào)通路機(jī)制研究方面的作用.

1 材料與方法

1.1 材料

pHIV LTR－Luc、pHIV LTRΔκB－Luc和pHIV LTRΔTAR－Luc由Warner C.Greene實(shí)驗(yàn)室提供.

大腸桿菌DH5α、pcDNA3.0質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存；各種限制性內(nèi)切酶，以及T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司.PCR引物、DNA序列測定均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

以pHIV LTR－Luc報(bào)告質(zhì)粒為模板，用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增HIV LTRLuc片段.引物由上海英駿公司合成，序列如下：LTRNdeI－5'－GGTACATATGTGGAAGGGCTAATT TGGTC－3'和LUCXhoI－5'－AATACTCGAGATTCGTTAAAATAGTACAGTGACCC－3'.PCR反應(yīng)按以下參數(shù)進(jìn)行：94℃3min；（94℃30s，56℃30s，72℃150s）×32；70℃10min.膠回收PCR產(chǎn)物，用NdeⅠ和XhoⅠ分別酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.0載體.回收DNA片段，并用T4DNA連接酶16℃連接過夜.連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素（終濃度50μg／mL）的LB平板中培養(yǎng)過夜后，挑選菌落抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定.

1.2.2 轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

24孔板中每孔接種5×105個(gè)293細(xì)胞，待培養(yǎng)板中細(xì)胞覆蓋率在95%以上，用Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑按照2μL∶0.8μg比例轉(zhuǎn)染pcDNA3.0－HIV LTR－Luc及其突變型質(zhì)粒.細(xì)胞在含800μg／mL新霉素（G418）培養(yǎng)液培養(yǎng)14d后，將細(xì)胞消化后按梯度稀釋種在96孔板中.待能夠看到明顯克隆后，尋找單個(gè)細(xì)胞克隆用胰酶消化擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定.

1.2.3 熒光素酶活性檢測

穩(wěn)定細(xì)胞克隆在高糖的DMEM（Gibco產(chǎn)品）細(xì)胞培養(yǎng)液中（含10%胎牛血清，100U／mL青霉素，100g／mL鏈霉素），37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞覆蓋率達(dá)到95%以上，加入終濃度為10ng／mL TNF－α［11］或10μmol／L PMA（Phorbol－12－myristate－13－acetate，PMA）的培養(yǎng)液培養(yǎng).培養(yǎng)18h讓藥物充分作用后，棄去上清，用PBS清洗細(xì)胞.然后按照熒光素酶檢測試劑盒（Dual Luciferase Assay System，Promega）說明書步驟操作：棄去培養(yǎng)基，用500μL 1×PBS清洗細(xì)胞；將PBS完全棄去后，每孔加入100μL的細(xì)胞裂解液，在搖床上裂解15min.將上述裂解細(xì)胞及上清收集到1.5mL的EP管內(nèi)，12000r／min離心1min.保留上清進(jìn)行后續(xù)檢測.樣品放冰上，用冷光儀（Lumat LB 9507）檢測細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的表達(dá)水平.同時(shí)設(shè)立不加藥組、加藥組和沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的人胚胎腎細(xì)胞293細(xì)胞作為空白組.儀器參數(shù)設(shè)置見Lumat LB 9507操作手冊(cè).加藥組與未加藥組熒光素酶檢測值的比值可以用來表示藥物對(duì)于該體外系統(tǒng)中細(xì)胞中LTR的激活效果.每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以獲得平均值.

2 結(jié) 果

2.1 HIV－1LTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

以pHIV LTR－Luc為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出HIV LTR－Luc片段.然后通過Nde I和XhoI酶切，連接到pcDNA3.0質(zhì)粒的相應(yīng)位置，獲得pcDNA3.0－HIV LTR－Luc表達(dá)質(zhì)粒.LTR上κB和TAR元件突變的突變型質(zhì)粒構(gòu)建方法也與之類似，區(qū)別之處在于PCR的模板分別為pHIV LTRΔκB－Luc和pHIV LTRΔTAR－Luc.

將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株293－HIV LTR－Luc、293－HIV LTRΔκB－Luc和293－HIV LTRΔTAR－Luc.然后，分別提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.如圖1所示，PCR得到略小于2500bp的特異性條帶，與預(yù)期2300bp片段大小相符.PCR擴(kuò)增片段回收送樣測序，測序結(jié)果用MegaAlign軟件進(jìn)行比對(duì).比對(duì)結(jié)果顯示，293－HIV LTRΔκB－Luc中LTR上350nt位置的2個(gè)κB串聯(lián)序列被缺失突變，而293－HIV LTRΔTAR－Luc則在490nt附近有4bp的缺失（見圖1中下劃線標(biāo)注位置）.這些突變位點(diǎn)與野生型LTR中順式元件所在位置相符.

圖1 細(xì)胞株基因組DNA的PCR檢測及序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 The results of DNA PCR and sequence alignment

2.2 TNF－α對(duì)HIV－1LTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞模型的激活效果

為了驗(yàn)證這些細(xì)胞模型能夠通過熒光素酶表達(dá)反映HIV－1LTR的活性，我們采用10ng／mL的TNF－α［11］對(duì)這些細(xì)胞模型進(jìn)行處理冷光儀可以檢測熒光素酶表達(dá)水平，來反映TNF－α對(duì)于不同細(xì)胞模型的激活效果我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于野生型LTR的細(xì)胞模型來說，10ng／mL的TNF－α激活18h后熒光素酶表達(dá)水平是激活前的2.87±0.09倍（與對(duì)照相比，P＝0.017），PMA處理為激活前的1.7±0.11倍；而同樣條件下，缺失了κB位點(diǎn)的細(xì)胞株無明顯激活效果（TNF－α為0.96±0.07倍，PMA為1.00±0.13，P＞0.05，見圖2）對(duì)于TAR位點(diǎn)突變的細(xì)胞株，TNF－α對(duì)熒光素酶表達(dá)水平的激活效果與野生型LTR細(xì)胞株相比較弱（1.51±0.01倍，P＜0.05），PMA處理為1.3±0.12倍.

2.3 TNF－α對(duì)于同一細(xì)胞模型中不同細(xì)胞克隆的激活結(jié)果

圖2 TNF－α及PMA對(duì)野生型及突變型LTR細(xì)胞模型的激活效果Fig.2 The effects of TNF－αand PMA in wild－type and mutant LTR cell model

為了研究同一細(xì)胞模型中不同細(xì)胞克隆之間LTR對(duì)于熒光素酶的調(diào)控是否有較大區(qū)別，我們分別對(duì)該體外系統(tǒng)中每個(gè)模型選擇了3個(gè)不同的細(xì)胞克隆，同樣用10ng／mL TNF－α處理18h.結(jié)果顯示TNF－α對(duì)同一細(xì)胞模型不同細(xì)胞克隆的熒光素酶表達(dá)水平的激活有一定的差異，但是這種差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義（P＞0.05，見圖3）.

圖3 TNF－α對(duì)同一細(xì)胞模型中不同細(xì)胞克隆的激活效果Fig.3 The effects of TNF－αin different cell clone of the same model

3 討 論

HIV－1潛伏感染是造成抗病毒療法無法根除病人體內(nèi)病毒的主要原因.因此，如何清除HIV－1潛伏感染細(xì)胞是目前艾滋病治療的一個(gè)熱門方向［5］.而由于病人體內(nèi)潛伏感染細(xì)胞極其稀少，每個(gè)病人體內(nèi)最多也只有107個(gè)潛伏感染細(xì)胞［7］，這迫切需要我們建立一個(gè)有效的藥物篩選模型來輔助藥物篩選和進(jìn)行機(jī)制研究.

HIV－1LTR作為病毒基因轉(zhuǎn)錄重要的調(diào)控區(qū)，上面包含許多與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的順式元件［12］.這些順式元件與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)相互作用形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).在HIV－1潛伏感染的建立和維持過程中，NF－κB和Tat參與了至關(guān)重要的角色［4，8］.NF－κB一般情況下位于細(xì)胞質(zhì)中，與其抑制因子I－κB結(jié)合；在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)來時(shí)，NF－κB進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合到HIV－1LTR上的兩個(gè)串聯(lián)的κB增強(qiáng)子序列［13］.繼而通過直接募集組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）到HIV－1LTR上，觸發(fā)原病毒的激活［14］.Tat是由病毒基因組編碼的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白.研究表明，HIV－1轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，TAR先轉(zhuǎn)錄形成一小段有著莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA.Tat可以結(jié)合到由TAR轉(zhuǎn)錄形成的RNA，募集轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的一些重要組分，從而保證HIV－1轉(zhuǎn)錄延伸的順利進(jìn)行［15］.在缺失Tat的條件下，轉(zhuǎn)錄起始正常但是只產(chǎn)生一小段無效的轉(zhuǎn)錄本.Tat表達(dá)水平作為轉(zhuǎn)錄活化和潛伏的開關(guān)［16］，當(dāng)Tat在其他啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下反式表達(dá)時(shí)，HIV－1原病毒持續(xù)性活化并且不能進(jìn)入潛伏［16］.

突變型HIV－1LTR可以幫助我們有效地進(jìn)行藥物篩選和信號(hào)通路機(jī)制研究.Yang等就用缺失κB位點(diǎn)的NL4－3LTR驅(qū)動(dòng)的LUC報(bào)告質(zhì)粒建立瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，篩選到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Ets的一個(gè)突變型ΔVII－Ets－1能夠有效地激活靜止CD4＋T細(xì)胞中的HIV－1表達(dá)［17］.Williams等也通過ΔκB LTR的LUC報(bào)告質(zhì)粒，來研究Prostratin激活潛伏HIV－1表達(dá)的信號(hào)通路［10］.與這些瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)相比，我們建立的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)具備許多優(yōu)點(diǎn).由于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中質(zhì)粒DNA沒有整合進(jìn)基因組DNA中，會(huì)在細(xì)胞分裂的過程中被逐漸稀釋.這使得瞬時(shí)模型不能傳代，每次實(shí)驗(yàn)前都需重新轉(zhuǎn)染；而所用轉(zhuǎn)染試劑的不同，所轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA的量，以及細(xì)胞狀態(tài)都會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果.而在穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中，質(zhì)粒DNA整合進(jìn)基因組，隨著基因組進(jìn)行復(fù)制，因此可以傳代使用，也避免了不同實(shí)驗(yàn)者以及不同批次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的誤差，結(jié)果重復(fù)性高.為了驗(yàn)證模型的有效性，我們用TNF－α對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行激活，對(duì)比不同細(xì)胞模型和同一細(xì)胞模型中不同細(xì)胞克隆中熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)水平，能夠很好地說明我們建立的這套體外系統(tǒng)能夠很好地反映不同藥物對(duì)于HIV－1LTR的激活效果.

由于我們構(gòu)建的細(xì)胞模型與用野生型病毒［18，19］或者慢病毒［20］感染T淋巴細(xì)胞后篩選出來的潛伏感染細(xì)胞有所不同，細(xì)胞中整合的病毒基因組并非處于潛伏感染狀態(tài).因此，進(jìn)一步證明所篩選出來的藥物能夠激活潛伏感染病毒，還需在專門的潛伏感染細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證.此外，我們構(gòu)建的模型中HIV－1LTR上與潛伏感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控順式元件得到了突變，能夠進(jìn)一步用來篩選通過特定信號(hào)通路來激活HIV－1表達(dá)的藥物.我們期望這套體外系統(tǒng)能夠?yàn)镠IV－1激活劑的篩選工作提供便利.

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