易恒安，李敏，邱玉芬

(深圳市龍崗區(qū)橫崗人民醫(yī)院皮膚科，廣東深圳518115)

遺傳性對稱性色素異常癥一個家系DSRAD基因突變分析

易恒安，李敏，邱玉芬

(深圳市龍崗區(qū)橫崗人民醫(yī)院皮膚科，廣東深圳518115)

目的對遺傳性對稱性色素異常癥一個家系DSRAD基因突變進行檢測，以期尋找到新的致病突變。方法收集一患有遺傳性對稱性色素異常癥家系，該家系除了有典型的皮疹外，身體發(fā)育、智力均正常，五官科及內(nèi)科檢查正常，無明顯的系統(tǒng)癥狀，采用RT-PCR方法從人外周血中獲得DSRAD基因cDNA，并篩選出合適的基因序列與人類基因庫中的相應基因進行對比分析，找出可疑的位點，并通過單鏈構象技術對新突變進行驗證。結(jié)果該家族DSRAD基因序列的測定結(jié)果證實患者染色體中存在堿基替換的情況，患者堿基由Q389Q替換為A1167G，患者編碼氨基酸并沒有發(fā)生改變，仍然為谷氨基酸，屬于同義突變。患者DNA經(jīng)單鏈構象分析證實為同一家族的基因，在家族健康人及非血緣關系的人群中未發(fā)現(xiàn)編碼基因。結(jié)論患者皮膚色素出現(xiàn)異常的改變可能與患者基因出現(xiàn)同義突變有關，但目前該突變機制的研究還有待進一步深入分析。

遺傳性；對稱性；色素；DSRAD基因；突變

遺傳性對稱性色素異常癥(DSH)屬于人類常染色體中顯性基因異常的疾病，其外顯率較高，目前改病的發(fā)生機理尚不明確。近年來國內(nèi)外已有相關的遺傳學家對其致病機理從遺傳學的角度進行研究，并確定了該疾病的出現(xiàn)是由于患者體內(nèi)雙鏈RNA上的DSRAD出現(xiàn)突變引起的[1]。目前相關研究已經(jīng)證實在DSH患者中存在著40多處這種突變。為了更深入了解患者DSRAD突變過程，本文對DSH家族中存在的DSRAD基因突變進行檢測確認，并對DSRAD突變對皮膚代謝產(chǎn)生的作用進行分析，現(xiàn)分析結(jié)果如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料于2012年1～6月選取DSH疾病家系中3代的人群為研究對象，共12人，其中患者6例，先證者是15歲的女性，患者智力、體格發(fā)育與同齡人無疑，不存在系統(tǒng)性疾病?；颊?歲開始表現(xiàn)在手背部出現(xiàn)色素減退的現(xiàn)象，隨著患者年齡的增長，其色素退斑現(xiàn)象變得顯著，同時伴有皮損蔓延及色素沉著斑點的現(xiàn)象。目前患者病情已經(jīng)發(fā)展至右腳踝及侵入到手背部，皮損現(xiàn)象在夏季尤為明顯，冬季病情減輕。隨著年齡的增加，其色素沉著現(xiàn)象顯著，皮損出現(xiàn)蔓延。先證者的母親從2歲開始初見皮損，隨著年齡增加，皮損顯著明顯，色素沉著情況嚴重，面部出現(xiàn)雀斑?；颊呔司艘渤霈F(xiàn)類似的癥狀，患者四肢出現(xiàn)深淺不一的色素減退斑，其臨床癥狀符合DSH，但患者皮膚、毛發(fā)及牙齒均表現(xiàn)正常。

1.2 方法(1)DNA提?。翰捎酶牧见}析法提取基因組DNA；該方法操作步驟簡單，DNA損失少，獲取率高，而且該法所用的試劑價格便宜，性質(zhì)穩(wěn)定，不需特殊實驗條件及蛋白酶K，所得DNA純度高。(2)基因組mRNA的提?。翰杉劝Y者與一名正常家系成員靜脈血5 ml以提取mRNA。(3)RT-PCR獲取cDNA。(4)設計DSRAD基因的引物：根據(jù)引物設計原則和GenBank中公布的人DSRAD基因的cDNA序列，通過Primer5.0軟件進行引物設計。由于DSRAD基因的CDS區(qū)有3 680多個堿基，所以擬設計3對PCR特異性引物擴增該基因全長。(5)聚合酶鏈式反應(PCR)：由“變性——退火——延伸”三個基本反應步驟構成。(6)切膠回收特異性目的條帶：在紫外光下用干凈鋒利的刀片切下瓊脂糖凝膠中的目的片段并進行回收。(7)連接：回收的目的片段DNA與pTA2載體進行鏈接。(8)制備感受態(tài)細菌DH5α。(9)轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細菌，轉(zhuǎn)化后涂布于含有Amp，X-gal和IPTG的LB平板上于37℃培養(yǎng)箱過夜。(10)陽性克隆鑒定：隨機挑取約5個白色菌落以DSRAD引物進行菌落PCR，鑒定出目的基因的陽性克隆。(11)DSRAD的序列測定與分析：將經(jīng)過鑒定的陽性克隆生物技術有限公司進行測序，將測序結(jié)果通過BLAST程序網(wǎng)上比對找出可能的突變位點。(12)單鏈構象多態(tài)性分析。(13)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。(14)銀染。

2 結(jié)果

采用PCR擴增法克隆DARAD后與BLAST比對，發(fā)現(xiàn)在DSRAD中第1167位點的堿基中存在著可疑的突變，堿基上的起始密碼ATG中的A突變?yōu)镚，從而引起399位的CAA密碼子轉(zhuǎn)化為CAG，但編碼的氨基酸種類并沒有發(fā)生改變，仍然為谷氨酰胺。通過SSCP分析獲知患者染色體存在異常，而在正常的家族成員及非血緣關系的人群中不存在此情況。

3 討論

DSH是屬于常染色體的顯性突變，因此在患病者家族中表現(xiàn)的是顯性病癥[2]。高敏等在2003年時對該病進行了相應的研究，將致病基因定位在1號常染色體11.6厘摩爾的區(qū)域內(nèi)，Miyamura等認為該病的突變位點是在該區(qū)間的DSRAD區(qū)域內(nèi)，該基因?qū)儆贏DAR族的成員[3]。ADAR基因廣泛存在于自然界各種生物中，其生物學功能是能夠誘導蛋白質(zhì)翻譯及對RNA進行轉(zhuǎn)錄。該基因段全長為30 kb，由15個外顯子組成，最長的轉(zhuǎn)錄基因為6.7 kb，其編碼基因中含有1 226個腺苷脫氨酶(編碼含有1 226個氨基酸序列的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶)該酶能用于信使RNA中的中的序列與DNA上的酶不對應，從而產(chǎn)生特定的生物學性能[4]。相關研究顯示該酶中存在2個Z區(qū)及1個alpha區(qū)，從而引導蛋白質(zhì)向發(fā)生轉(zhuǎn)錄的DNA靠近，同時對RNA產(chǎn)生作用[5]。雙鏈RNA結(jié)合區(qū)是由2～7號的外顯子進行編碼的，能識別底物，同時與底物進行結(jié)合[6]。如果該酶位點出現(xiàn)缺失會導致其不能形成二聚體，從而影響該基因的功能，導致疾病的發(fā)生。

引起該病突變的主要原因是基因的錯義突變，其次是堿基插入或缺失引起的基因代碼出現(xiàn)無義性突變[7]。本研究采用PCR擴增法對DSRAD基因進行序列測定或全克隆，同時在采用SCCP技術進行突變的鑒定，從而發(fā)現(xiàn)患者第1 167位點中的堿基由A替換為G，在正常家族人群或非血緣關系的人群中未出現(xiàn)此種突變。該突變一般情況下不會引起氨基酸序列的改變，但核苷酸改變會導致患者轉(zhuǎn)錄效率受到影響，同時氨基酸及密碼子的翻譯效率并不相同，可引起蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化，最終引起疾病發(fā)生[8]。

對DSRAD基因變異進行分析，能有效了解對稱性色素遺傳異常疾病的發(fā)生的機理，從而為臨床對該病的診斷及治療提供臨床理論依據(jù)。

[1]張國龍,施和建,邵敏華,等.遺傳性對稱性色素異常癥兩家系基因突變檢測研究[J].臨床皮膚科雜志,2011,40(3):958-957.

[2]林志淼,徐輝,李巖,等.遺傳性對稱性色素異常癥兩家系ADAR基因的突變[J].中國皮膚性病學雜志,2008,22(8): 470-471.

[3]佃艷,孟巖,王錚,等.遺傳性對稱性色素異常癥一家系中ADAR基因的新突變[J].醫(yī)學研究雜志,2009,38(1):17-19.

[4]李明,楊莉佳,華?？?等.遺傳性對稱性色素異常癥1例家系調(diào)查及其病因研究[J].臨床皮膚科雜志,2007,36(1):3-5.

[5]董穎穎,肖生祥,任建文,等.遺傳性對稱性色素異常癥2個新的致病基因突變檢測[J].中國皮膚性病學雜志,2009,23(5):348-350.

[6]Kondo T,Suzuki T,Mitsuhashi Y,et al.Six novel mutations of the ADAR1 gene in patients with dyschromatosis symmetrica hereditaria:histological observation and comparison of genotypes and clinical phenotypes[J].J Dermatol,2008,35(7):395-406.

[7]王曉鵬,劉艷,肖生祥,等.兩個遺傳性對稱性色素異常癥家系的DSRAD基因剪切突變[J].中國皮膚性病學雜志,2010,24(5): 502-504.

[8]李艷雯,汪峰,黎宇.遺傳性對稱性色素異常癥家系中ADAR1基因的遺傳分析[J].重慶醫(yī)學,2012,41(2):117-118.

Mutation analysis of DSRAD gene in a Chinese family with dyschromatosis symmetrica hereditaria.

YI Heng-an,LI Min,QIU Yu-fen.Department of Dermatology,Henggang People's Hospital of Longgang District of Shenzhen City,Shenzhen 518115,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo detect the mutation of DSRAD gene in a Chinese family with dyschromatosis symmetrica hereditaria(DSH),and to explore new pathogenic mutation.MethodsMembers of a Chinese family with DSH,who had typical rash,were enrolled in this study,with normal physical development and intelligence,no obvious systematic symptoms.RT-PCR was applied to obtain DSRAD gene cDNA from human peripheral blood.Proper gene sequences were selected and compared with corresponding gene of human gene pool to identify suspicious sites, and new mutations were validated by single strand conformation.ResultsDSRAD gene sequence analysis confirmed the presence of nucleotide substitutions in the patient's chromosomes,with Q389Q replaced by A1167G.The encoding amino acid was still glutamic acid,which indicated a synonymous mutation.Single strand conformation confirmed that the DNA of the patients was of the same family,and that the healthy members and non-kinship members were not detected with the coding gene.ConclusionThe abnormal changes of skin pigment may be due to synonymous mutations in gene.The mutation mechanism still needs further study.

Hereditary;Symmetry;Pigment;DSRAD gene;Mutation

R394

A

1003—6350（2013）09—1266—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0535

2012-12-14)

易恒安。E-mail：164460075@qq.com