陳惠 辛麗麗 龔婕寧

近年來，功能基因組學技術已經廣泛運用于動植物生理生化、腫瘤與干細胞、動植物分子育種及中醫(yī)藥研究等領域，并促進了相關領域的發(fā)展。功能基因組學研究包括轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學研究，轉錄組學的研究是其中最為重要的一部分。在中醫(yī)藥研究中，隨著分子生物學前沿技術的大量應用，人們已經從多層次、多角度對中醫(yī)學的辨治理論及方藥的作用機制進行了深入探討，取得了眾多令人矚目的研究成果。鑒于轉錄組學在功能基因組學中所處的重要地位，筆者認為，將轉錄組學的新方法——全轉錄組測序(RNA-Sequence，RNA-Seq)技術應用于中醫(yī)藥研究，可以促進該領域的快速發(fā)展[1]。

近幾年，RNA-seq技術迅速發(fā)展，2012年美國推出了TotalScriptTMRNA-seq試劑盒，一個完整的轉錄組測序只需約5 ng的總RNA樣品(含有rRNA)且不需要片段化RNA[2]，甚至能完成單細胞水平的轉錄組分析[3]。同年國內華大基因也推出微量轉錄組測序技術(TruSeq)，從而實現了高效、穩(wěn)定的微量轉錄組測序。成熟的轉錄組分析技術，尤其是新興的RNA-seq技術，以其整體性、系統性、個體組織差異性、時間獨立性等優(yōu)勢，可以更好的從基因水平闡明中醫(yī)學的辨治原理、方藥的作用機制等問題。尤其是該方法改善了以往單基因研究不能切合中醫(yī)學整體觀念的不足，因而是當前中醫(yī)藥研究應當重視的重要方法。

1 RNA-seq技術在轉錄組學中的優(yōu)勢

轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理。轉錄組學提出之初采用的是基因芯片法，它利用固定探針與樣品(cDNA)進行分子雜交，根據雜交圖譜熒光信息的強弱測定基因的表達豐度。該技術在過去幾年里以其操作簡便、快速和低廉的特點成為轉錄組分析的主導技術。但基于芯片技術只限用于已知基因序列,無法檢測新的RNA，也就無法應用到還未完成全基因組測序和基因注釋的物種上；而且雜交技術靈敏度有限,不能很好地分辨基因序列同源性較高的基因家族和難以檢測低豐度的目標及重復序列，更不能發(fā)現異常轉錄的基因。因此，在許多情況下不能滿足當前研究的需要。

隨著測序技術的發(fā)展，RNA-seq技術開始逐步取代芯片技術。該技術首先將細胞中的所有轉錄產物反轉錄為cDNA文庫，然后將cDNA文庫中的DNA隨機剪切為小片段，在cDNA兩端加上接頭利用新一代高通量測序儀測序,直到獲得足夠的序列,所得序列通過比對或從頭組裝拼接，形成全基因組范圍的轉錄譜；同時通過同已有的基因組序列比對得到基因轉錄后拼接和修飾的機制；也能通過基因序列出現的次數來檢測基因表達的豐度。

相比較芯片技術，RNA-seq技術采用數字化信號，靈敏度高，能檢測到低豐度表達的基因，檢測到單個堿基的差異和對RNA表達的定量化研究；測序成本比基因芯片低；不需要預先設計探針，適用于所有物種(包括沒有全基因組測序的)；而且測序結果得到的是完整的RNA序列[4]。因此，借此可以發(fā)現一些新基因和進一步完成單個堿基水平和全基因組范圍的生物信息學分析和基因功能的研究。

2 RNA-seq技術在中醫(yī)學研究領域中的應用

2.1 RNA-seq技術用于中醫(yī)辨治理論實質的研究

辨證論治是中醫(yī)學的精髓，是臨床診治疾病的重要方法。雖然近年發(fā)展迅速的數據挖掘技術促進了中醫(yī)學辨證客觀化的研究，使得中醫(yī)證候診斷標準具有了一定的規(guī)范性和客觀性[5],但由于辨證主要依據病人的主觀感覺和醫(yī)生四診所得的臨床資料進行綜合分析，缺乏深層次的客觀標準，所以“證”的確立與臨證醫(yī)家的思辨能力和診療水平密切相關,很難做到真正意義上的客觀化和量化。運用現代研究技術手段對中醫(yī)“證候”的本質進行研究，已經經過了近60年的過程。在已有的報道中，有關“證候”實質的轉錄組研究已有人作了初步的嘗試。例如，馬曉娟等[6]經基因芯片分析和QRT-PCR驗證研究血瘀證患者差異基因表達譜,篩選出差異基因共有48個。嚴石林等[7]分析了不同疾病腎陽虛證的轉錄組特征，通過對差異表達基因進行Pathway分析，找出332條共同差異表達基因，其中有注釋的基因為181條，探討了腎陽虛證“同證異治”的生物學基礎。這些差異表達的基因為中醫(yī)證候本質的研究開啟了一扇大門。

在各種先進診療設備趨于完善的今天，辨病施治可以提高醫(yī)生的診療速度與準確度，輔助醫(yī)生處方用藥。轉錄組技術尤其是芯片技術以其快速、高效、靈敏、經濟等優(yōu)點已經在疾病診斷上發(fā)揮了巨大作用。在西醫(yī)學領域，轉錄組學已大量運用于疾病的診斷。中南大學黃進等[8]將分支DNA液相芯片技術應用于胃癌相關基因表達的檢測，以用于評定化療療效。約翰霍普金斯大學醫(yī)學院朱教授對蛋白芯片技術的應用做了回顧，并舉例說明蛋白芯片技術可以在基礎和臨床中廣泛應用，并發(fā)揮巨大作用[9]。可見，芯片技術已經廣泛應用于疾病診斷中。

辨證論治與辨病施治是當今臨床醫(yī)生診治疾病基本方法，其中辨證論治突顯中醫(yī)特色、辨病施治突顯西醫(yī)特色，中醫(yī)臨床大多強調辨證與辨病相結合。轉錄組學利用芯片技術在揭示“證”與“病”的實質方面已經取得了可喜的成就，但轉錄組學對中醫(yī)證候研究和疾病診斷上本身尚存在許多不足，如不能適應基因表達的多態(tài)性、信息含量不夠全面、敏感性和準確度不夠高等；加之芯片技術本身也存在一些局限性，一種芯片只能檢測有限的基因和診斷一種或幾種疾病，對于復雜證候則束手無策。因此，引入RNA-seq技術就十分必要。該技術能夠很好地解決這些問題，通過RNA-seq技術可以獲得不同病變組織、不同時間段的基因表達譜，分析表達譜從而找到一系列差異表達的基因，進而結合數據庫進行基因的功能比對和構建疾病影響的代謝調控網絡[10]。也可進一步挖掘不同個體病例的表達譜，結合人類基因組計劃，構建一個病例與整體或組織器官特異表達譜相對應的診斷數據庫，通過病人表達譜數據與數據庫中已建立的證型特異基因表達譜進行生物信息學比較分析，初步對病人做出診斷[11]。所以，證候實質的研究還有很多工作需要完善，首先是標準證型模型的建立，然后是相關證型數據庫的建立，可以設想，倘若中醫(yī)證型數據庫與疾病數據庫均足夠龐大，僅通過一次RNA-seq測序，就應當能做到對病人進行疾病和證候的診斷，并為精確治療提供指導，從而大大提高臨床療效。

2.2 RNA-seq技術用于方藥有效成分的篩選和作用機制研究

中醫(yī)臨床治療疾病，以中藥復方為主要手段。實踐證明，大多數疾病的療效，是通過大量中藥有效成分來發(fā)揮作用的，因此不能通過傳統的單靶標藥物篩選來研究中藥有效成分，而應從多靶點的研究策略出發(fā)。長期以來，由于中藥復方成分過于復雜，為其機制研究帶來很大難度。芯片技術的應用，為解決這一難題提供了新的手段，迄今已取得了一定成果。如劉喜德等[12]研究發(fā)現，溫化蠲痹湯干預膠原誘導性關節(jié)炎大鼠后，大鼠滑膜基因有222條差異表達，這些差異表達基因主要涉及細胞凋亡、血管生成、信號轉導等。王東生等[13]構建了大黃蟲丸治療動脈栓塞患者前后的基因表達譜，篩選出了血小板中243個差異基因?？梢?，芯片技術在方劑的研究上已經突顯優(yōu)勢，鑒于RNA-seq技術在各方面更優(yōu)于芯片技術，因此，RNA-seq技術應用于方劑研究可加快研究進度與準確度。利用RNA-seq技術建立不同方劑處理前后的表達譜數據庫，通過比對現有的研究成果(如NCBI數據庫)，構建藥物影響的代謝網絡通路，進而解析方劑的作用機制，也許是該領域研究取得突破的關鍵環(huán)節(jié)。

幾千年的中醫(yī)藥學有其獨特的優(yōu)勢，但受到有效成分及作用機制不明確等因素影響而不能被西醫(yī)體系所普遍接受。因此，在中藥研究方面，篩選治療疾病的有效藥物并探討其作用機制歷來是其重要內容。以腫瘤防治為例，從中藥中提取分離得到的抗腫瘤成分,包括三尖杉堿、紫杉醇、羥基喜樹堿和長春堿類等,已經成為療效明確的抗腫瘤藥物[14]。目前，腫瘤防治的相關研究已從單純的細胞靶向殺滅逐步向腫瘤微環(huán)境方向轉移，抑制腫瘤轉移是腫瘤防治的關鍵環(huán)節(jié)，中醫(yī)藥在防治腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了較大作用。賀用和[15]總結了中藥和西藥在腫瘤轉移的應用情況，并指出中藥治療相較西藥的手術、放化療等不良反應少，且能減輕病人的痛苦而更易被患者所接受。孫大志[16]通過比較小鼠注射了MNK-45胃癌細胞間質液和生理鹽水等對照的實驗，證實了中醫(yī)胃癌痰證理論和細胞間質相關，從而說明化痰是抑制MNK-45胃癌轉移的重要方法。關于腫瘤轉移的研究，近幾年進展迅速，繼種子與土壤學說之后，腫瘤干細胞與腫瘤轉移、上皮間質轉換與腫瘤轉移、腫瘤休眠與腫瘤遠期轉移逐步被提出，中醫(yī)藥在抑制腫瘤轉移方面作用凸顯，現已發(fā)現多種抗腫瘤轉移中草藥，如白花蛇舌草、半枝蓮、人參、仙鶴草等。另外，很多學者對其機制也作了初步研究，王秀峰等[17-18]對近幾年中藥及其成分干預腫瘤轉移的研究報道進行歸納總結，其中當歸中提取的果膠多糖能夠增強機體B細胞和巨噬細胞的免疫功能，抑制腫瘤細胞的轉移；去甲斑蝥素通過下調橋粒核心糖蛋白，N-鈣黏蛋白，A、B連環(huán)蛋白的表達降低黏附；吳茱萸堿能夠通過抑制ERK的磷酸化來減少VEGF的表達,抑制腫瘤轉移等。鑒于中藥的有效成分及抗癌機制研究仍處在較初級階段，加快篩選有效抗癌中藥，并明確其有效成分及作用機制是需要努力的方向。在具體研究中，首先應當從一些有明確抗癌療效的臨床方藥入手來研究中藥抗癌機理和有效成分的篩選。而且，RNA-seq技術可以同其它一些分子生物學手段結合起來，通過構建腫瘤對中藥應答的轉錄譜，找出差異表達的基因，從而架構信號調控網絡。選擇其中一些基因作為藥物篩選的maker基因，并結合熒光定量PCR (QRT-PCR)檢測maker基因的表達量，以之作為檢驗藥物有效性的標準。近來，隨著多能干細胞誘導(IPS)細胞體內外誘導分化技術(該成果已在2012年獲諾貝爾醫(yī)學獎)的成熟，為藥物篩選提供了充足的細胞材料[19]。選取病人的病變組織細胞，體外誘導成無限擴繁的IPS細胞系,以不同藥物組合處理這些細胞并獲得細胞的表達譜數據[20]，并以marker基因的表達情況為檢測標準篩選藥物的有效成分,然后在結構生物學、藥物化學、網絡藥理學的協同應用下，以及采用現代藥物開發(fā)技術等，進一步對這些有效成分進行改造和組合，可以開發(fā)出更高效、更健康的抗腫瘤藥物。

2.3 RNA-seq技術用于臨床用藥安全評定體系的建立

純天然的中草藥并非是安全無毒的綠色藥物。在肯定中藥療效的同時，必須做好安全性評價體系，這是中醫(yī)藥走向現代化必備的基礎。由于中藥毒性的產生和其藥效的作用模式是相通的,因此其安全性檢測也必須強調系統化、動態(tài)化和整體化[21]。傳統中藥安全性評價主要采用一般化學藥物的研究思路，即著眼于有效成分(或毒性成分)進行研究,存在著不可忽視的片面性，同時也沒有一個固定的標準化評定體系，使中藥的有效性和安全性受到一些質疑。針對這一現狀，有專家指出在原有研究的基礎上，是否可以借助轉錄組學技術做進一步的深入研究，如通過相關RNA-seq數據的分析，檢測藥物是否引起了一些參與重要代謝途徑的蛋白的表達變化，根據表達量的變化來初步判定這些藥物是否具有潛在毒性,或把表達譜數據與有毒化合物的毒理效應數據庫比對，觀察此類中藥是否含有這些毒性化學物質并反應其毒性的強弱程度[9]。因此，可以把RNA-seq表達譜作為臨床用藥安全評定的標準之一。

3 RNA-seq技術在中醫(yī)藥領域應用策略分析

如上所述，RNA-seq技術數字化、系統化的特點在中醫(yī)藥研究中可以大展身手，但要使其發(fā)揮出更大的作用，尚應當重視以下關鍵環(huán)節(jié)。

3.1 應加強疾病及病證動物模型的研究

RNA-seq技術應用于中醫(yī)藥研究離不開很好的病證動物模型。目前，一些疾病及中醫(yī)證候動物模型的建立及調控尚存在一定難度，并且如何將目的基因差異表達的程度和疾病時期、藥物劑量等聯系起來還不十分清楚，因此RNA-seq技術可先與病證動物模型研究相結合并把研究數據作為人類疾病診斷和治療的參考。目前已經利用在組織結構上、生理代謝上和人體有很大相似性的小鼠、大鼠、小型豬建立了多種疾病模型[22]，同時這些模式生物都已完成了全基因組測序、基因注釋，并在很多疾病上有了較好的分子生物學研究基礎，但仍然缺乏公認、成熟的病證結合模型。因此，加強對疾病和證候模型的研究，逐步建立和完善病證轉錄組數據庫，可為中醫(yī)臨床精確診斷、對癥下藥、同病異治奠定基礎。

3.2 應加強對mRNA修飾和蛋白質修飾的研究

目前，轉錄組學分析還只是停留在轉錄水平上?；蚪M中只有少部分基因表達成mRNA，大部分基因只是起調控作用，mRNA只是基因調節(jié)生命活動的中間體，更多的生命活動體現在轉錄后的mRNA修飾和翻譯后的蛋白質修飾上?，F有大量研究表明非編碼的RNA(ncRNA)起了重要調控作用，其中研究最熱的是microRNA(miRNA)。miRNA是22個左右核苷酸序列的小RNA，能夠靶向調控目標基因[23]。鄭思道等[24]的一篇綜述很好地概括了miRNA在中醫(yī)藥研究中的進展，miRNA參與了中藥有效成分對腫瘤的調控?，F有報道人類總共含有一千多個miRNA[25]，miRNA表達的特異性和時序性與中醫(yī)證候的動態(tài)時空特征極其相似，如王階等[26]提出將miRNA引入冠心病中醫(yī)證候的研究，借助miRNA芯片及生物信息學技術，建立和證候相關的miRNA調控網絡，為從轉錄水平研究中醫(yī)藥提供了新的視角。隨著RNA-seq技術的發(fā)展還會發(fā)現更多參與疾病調控的microRNA，并闡述其調控的分子機制。另外，蛋白質才是生命活動真正的體現者，有很多蛋白功能都是在翻譯后調控的，如甲基化、糖基化和磷酸化/去磷酸化等修飾作用，其RNA轉錄量并沒有任何改變。因此，充分利用RNA-seq技術，加強對mRNA修飾和蛋白質修飾的研究，促進基因組學加深對功能基因和調控基因功能和結構的認識，進一步豐富各種蛋白質、次生代謝物的數據庫，可以幫助人們在蛋白組學、代謝組學水平上更深層次地研究中醫(yī)藥學。

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