張 磊，李金陽(yáng)，朱克旭

1975年，Kohler和Milstein將分泌抗體的B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體[1]。隨后，1986年，美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了第一個(gè)用于治療的單克隆抗體[2]，一種定位于人類(lèi)的CD3的鼠源抗體。由于鼠源抗體具有免疫原性，導(dǎo)致在人體內(nèi)迅速地被清除，從而表現(xiàn)為低效率治療效果，高風(fēng)險(xiǎn)的輸液反應(yīng)，因此，除2002年的定位于 CD20，治療 Non－Hodgkin lymphoma的 Zevalin以外[3]，F(xiàn)DA沒(méi)有再批準(zhǔn)任何的鼠源抗體。1994年，第二個(gè)治療性抗體由 FDA 批準(zhǔn)上市，ReoPro[4]，anti-GpⅡb/gpⅡa，治療心血管疾病，抗體的類(lèi)型為嵌合型抗體，標(biāo)志著抗體的發(fā)展有了明顯的傾向-人源化。

1 抗體人源化的歷程

隨著對(duì)抗體結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的深入，鼠源抗體局部到整體的人源化逐步實(shí)現(xiàn)經(jīng)歷了3個(gè)過(guò)程。(a)首先出現(xiàn)的是Fc片段被人源化，保留鼠源的Fab。Fab是負(fù)責(zé)抗體與抗原識(shí)別的區(qū)域[5]，而Fc是控制抗體體內(nèi)效應(yīng)功能的部分。(b)將鼠源的Fv區(qū)和人源的恒定區(qū)相連，減小了鼠源片段的大小，這樣的抗體稱(chēng)為人鼠嵌合抗體。嵌合抗體能夠極大的減小免疫原性，接受抗體治療體內(nèi)產(chǎn)生人抗鼠抗體(human anti－mouse antibodies，HAMA)的患者比例[6]可以顯著降低。(c)將鼠源抗體的CDR(complementarity determining region)區(qū)移植到同源的人類(lèi)抗體 β-sheet骨架區(qū)(CDR －grafting)[7]，能夠繼續(xù)減低產(chǎn)生HAMA的風(fēng)險(xiǎn)。CDR-grafting的抗體被稱(chēng)為人源化抗體(humanized antibody)[8-9]。事實(shí)上，人源化抗體僅僅只是比嵌合抗體免疫原性低。

如今，用于治療的全人化抗體也已經(jīng)產(chǎn)生，即完整抗體全部都是來(lái)源于人的基因。目前產(chǎn)生全人化抗體有2種方法，分別是重組抗體文庫(kù)的不斷突變與篩選和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[10-11]，涉及展示技術(shù)在內(nèi)的多種新技術(shù)。

2 通過(guò)重組抗體文庫(kù)突變與篩選獲得全人化抗體

由重組抗體文庫(kù)分離產(chǎn)生抗體原理上模擬體內(nèi)產(chǎn)生抗體的過(guò)程，多種選擇平臺(tái)均包含免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的幾個(gè)關(guān)鍵步驟:首先是通過(guò)克隆多樣化連接的抗體基因，構(gòu)建抗體基因文庫(kù)。然后，應(yīng)用不同的展示技術(shù)，表達(dá)抗體基因，將抗體的基因型和表型偶聯(lián)。再然后是通過(guò)抗原作用，施加選擇壓力，挑選合適的抗體。最后，擴(kuò)增篩選出來(lái)的抗體。將獲得的抗體基因進(jìn)行突變處理，用于新一輪的篩選，如此循環(huán)，直至獲得滿(mǎn)意的抗體。

2.1 重組抗體文庫(kù) 總體上包括2種類(lèi)型:第1種是從免疫的動(dòng)物或者是自然感染的人體內(nèi)分離得到的，針對(duì)于某種抗原，具有一定程度特異性的免疫抗體基因庫(kù)[12]。第2種是由非免疫來(lái)源或者是半合成的非免疫抗體基因庫(kù)，不具有傾向性。

2.1.1 免疫抗體文庫(kù) 首先從B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增出抗體的重鏈和輕鏈群，然后將它們連入合適的載體表達(dá)隨機(jī)的聯(lián)合抗體文庫(kù)。相比于雜交瘤技術(shù)，用相同的免疫供體，重組免疫文庫(kù)的方法可以獲得更多的抗體，并且可以用體外選擇來(lái)富集天然很稀少的抗體類(lèi)型。免疫文庫(kù)能夠用于分離非免疫文庫(kù)不容易產(chǎn)生的人體免疫和疾病相關(guān)的特殊性質(zhì)的抗體，同時(shí)還可以用于分子水平的體液免疫系統(tǒng)的研究。如果需要，用免疫文庫(kù)的方法可以保持天然細(xì)胞內(nèi)重鏈和輕鏈的連接，也可以高通量的擴(kuò)增出單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的重鏈和輕鏈。

2.1.2 非免疫文庫(kù) 來(lái)源于非免疫供體或者是半合成的抗體文庫(kù)并不針對(duì)于某一種特定的抗原，因此它們能夠用于分離針對(duì)于各種各樣不同性質(zhì)抗原的抗體。非免疫抗體庫(kù)起源于天然的、未免疫的重組V區(qū)基因，文庫(kù)減少了抗原傾向性，能夠用于分離免疫文庫(kù)很難獲得的針對(duì)自身抗原的抗體。完全合成抗體文庫(kù)是完全于體外構(gòu)建，合成的多樣性避免了體內(nèi)天然抗體庫(kù)的傾向性和抗體冗余的影響，允許人工對(duì)V區(qū)基因遺傳組成和抗體多樣性程度的控制[13]。半合成的抗體庫(kù)繼承了天然抗體庫(kù)和完全合成抗體庫(kù)的優(yōu)點(diǎn):增加了天然抗體庫(kù)的多樣性，而保持了一定程度上功能的多樣性。

2.2 抗體文庫(kù)篩選技術(shù)

2.2.1 噬菌體展示 Fd和M13噬菌體展示是用于抗體文庫(kù)展示和篩選使用最廣泛的方法。將抗體片斷表達(dá)于噬菌體分子表面，它的編碼基因融合于噬菌體的一個(gè)包膜蛋白克隆進(jìn)入能夠被包裝成為噬菌體顆粒的載體之中。最常用的系統(tǒng)是:(a)使用方便、篩選更高親和力抗體的單價(jià)展示，(b)通過(guò)直接融合或者二硫鍵橋?qū)⒖贵w與小衣殼蛋白pIII連接，(c)同時(shí)用相比噬菌體載體更容易克隆的噬菌粒去操作。

目前，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于如下幾個(gè)方面:非免疫和合成抗體文庫(kù)高親和力抗體的分選[14]，包括針對(duì)于人體自身抗原的抗體的分選，通過(guò)親和成熟體外產(chǎn)生皮摩爾級(jí)親和力抗體[15]，從動(dòng)物或人類(lèi)供體的免疫或者非免疫文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)獨(dú)特性質(zhì)的抗體[16]。

2.2.2 核糖體和mRNA展示 在核糖體展示中，核糖體將抗體和編碼的mRNA聯(lián)系在一起，在翻譯結(jié)束以前，核糖體被停止住，而不釋放出多肽。整個(gè)三元復(fù)合物作為整體用于篩選[17]。嘌呤霉素作為轉(zhuǎn)換分子建立抗體和mRNA之間的共價(jià)鍵。

核糖體展示技術(shù)是較新的方法，它依賴(lài)于抗體片斷與編碼抗體的mRNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，分離mRNA，然后擴(kuò)增，獲得抗體的基因。這種方法已經(jīng)成功應(yīng)用于抗體的親和成熟領(lǐng)域[18-20]。

2.2.3 微生物細(xì)胞展示 酵母細(xì)胞展示技術(shù)將抗體與酵母細(xì)胞壁上定位的α-凝集素酵母黏附受體相融合，展示于細(xì)胞表面。此種方法用于構(gòu)建人類(lèi)非免疫scFv文庫(kù)，獲得了超過(guò)109克隆，能夠有效的用磁珠選擇然后流式細(xì)胞術(shù)分選產(chǎn)生幾納摩爾親和力的抗體[21]。噬菌體展示和酵母展示相結(jié)合[22]，使用酵母細(xì)胞交配體系產(chǎn)生組合多樣性約1014克隆數(shù)的文庫(kù)。

酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)可以結(jié)合流式細(xì)胞分選來(lái)篩選抗體文庫(kù)[21，23]。運(yùn)用隨機(jī)突變的方法來(lái)使得VH和VL基因多樣化，酵母展示可以獲得最高親和力的任何抗體(48fM)[24]。

2.2.4 其他篩選平臺(tái) 直接進(jìn)化的平臺(tái)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒展示[25]，慢病毒展示[26]，淋巴細(xì)胞展示[27]和體外區(qū)域化的微珠展示[28]等。雖然這些方法都有特定的理論優(yōu)勢(shì)，由于不同的原因，他們用于抗體文庫(kù)篩選的有效性仍然受到限制，而且理論的優(yōu)勢(shì)尚待實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.3 篩選抗體文庫(kù)的方法 篩選過(guò)程大致如下，噬菌體展示首先將抗體融合的噬菌體暴露于抗原分子，允許抗原特異性的噬菌體抗體結(jié)合。然后將結(jié)合的噬菌體洗脫感染細(xì)菌細(xì)胞。原則上只需一輪篩選，但是每一輪選擇過(guò)程都會(huì)有非特異性結(jié)合的影響，因此，多次循環(huán)的選擇和擴(kuò)增才能夠從文庫(kù)中選出最好的結(jié)合物。對(duì)于核糖體展示技術(shù)最好使用純化的抗原，而酵母細(xì)胞展示技術(shù)比較適合于細(xì)胞分選。

體外展示技術(shù)原理上可以直接用自動(dòng)化來(lái)操作，進(jìn)化過(guò)程主要依賴(lài)于對(duì)污染和非特異性擴(kuò)增非常敏感的PCR反應(yīng)，而沒(méi)有復(fù)雜的宿主細(xì)胞和噬菌體操作，體外區(qū)域化的核糖體展示和微珠展示都可以很容易通過(guò)自動(dòng)化操作。

2.4 抗體的親和成熟 抗體的效果主要由與抗原作用的親和力所決定，體內(nèi)免疫系統(tǒng)中，抗體的親和成熟是通過(guò)逐步的引入突變后，在不斷增加的選擇壓力下選擇突變體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。體外最初和最簡(jiǎn)單的親和成熟，是在與抗原相互作用緊密相關(guān)的若干殘基CDRs中，用寡聚核苷酸和PCR導(dǎo)入多樣性構(gòu)建抗體文庫(kù)，鑒定篩選最高親和力的單克隆[29]。在突變熱點(diǎn)和結(jié)構(gòu)分析得到的影響親和力重要位點(diǎn)的隨機(jī)突變，也是一種引入新突變體的有效方法。集中位點(diǎn)突變的優(yōu)點(diǎn)是開(kāi)始只有很小的文庫(kù)需要篩選，但是，缺點(diǎn)是需要同時(shí)結(jié)合篩選抗體的親和力和動(dòng)力學(xué)特性。

綜上所述，體外產(chǎn)生人源化抗體的過(guò)程就是首先構(gòu)建抗體展示文庫(kù)，包括免疫文庫(kù)和輔助合成的非免疫文庫(kù)，運(yùn)用噬菌體展示、酵母展示或者核糖體展示技術(shù)等，將抗體展示到固定化的抗原結(jié)合，通過(guò)優(yōu)化條件的溫浴、結(jié)合和洗滌、洗脫過(guò)程，自動(dòng)化的篩選合適親和力和動(dòng)力學(xué)特性的抗體。目前而言，展示技術(shù)還不能廣泛的應(yīng)用于完整IgG抗體的展示，需要首先片斷化展示后重建完整抗體分子。一輪文庫(kù)抗體展示篩選往往會(huì)因?yàn)榉翘禺愋缘慕Y(jié)合或親和力低下等原因，不能得到適合于診斷或治療的滿(mǎn)意分子。類(lèi)似于體內(nèi)的親和成熟過(guò)程可以進(jìn)行多次累積的突變和篩選，集中位點(diǎn)的突變和特異條件下篩選大范圍突變分子2種方法可以用來(lái)改善抗體的結(jié)合特性，重復(fù)的突變與篩選過(guò)程相結(jié)合可以得到高親和力的人源化抗體分子。

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