王 旭，顧海勇，尹 俊，朱靜峰，唐巍峰，陳鎖成

(江蘇大學附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

死亡受體通路是介導腫瘤浸潤T 淋巴細胞發(fā)生激活誘導的細胞凋亡［1］(AICD)的關(guān)鍵路徑，參與人類腫瘤免疫過程。該通路及其調(diào)節(jié)基因存在遺傳變異時，可能會影響個體免疫狀態(tài)而改變個體的腫瘤易感性。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8(CASP8)是死亡受體凋亡通路的重要起始型蛋白酶，只有當CASP8 被死亡信號募集并活化后，才能激活下游效應型蛋白酶，最終使細胞凋亡［2］。研究顯示，CASP8 mRNA 和CASP8 蛋白在食管鱗癌組織中表達明顯下調(diào)，提示CASP8的表達失調(diào)與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3～5］。已知基因的單核苷酸多態(tài)性可以影響基因的表達水平及蛋白酶的功能，因此，我們對CASP8 基因多態(tài)性和食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性進行了研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年10月～2009年11月就診江蘇大學附屬人民醫(yī)院、江蘇大學附屬醫(yī)院的食管癌患者355例，術(shù)前胃鏡及術(shù)后病理檢查均確診為鱗狀細胞癌。術(shù)中取淋巴結(jié)進行病理檢查，分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組85例和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組270例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，男62例、女23例，年齡(61.85±7.07)歲，吸煙39例、不吸煙46例，飲酒30例、不飲酒55例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組男187例、女83例，年齡(63.21±8.76)歲，吸煙107例、不吸煙163例，飲酒87例、不飲酒183例。兩組性別、年齡、吸煙及飲酒狀況比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 CASP8 基因多態(tài)性檢測 在獲得患者及家屬書面知情同意書后，空腹采集靜脈血2 mL，EDTA抗凝血，1 h 內(nèi)4 000 r/min 離心10 min，分離白細胞層，采用Qiagen DNA 提取試劑盒提取DNA?；蚍中筒捎蒙虾Ｌ礻簧锛夹g(shù)有限公司自主專利開發(fā)的2 ×48 位SNPscanTM高通量基因多態(tài)性分型技術(shù)。基于5'端及3'端雙側(cè)探針連接反應及多重熒光PCR 擴增、電泳分離從而獲取各基因多態(tài)性位點的基因型。實驗條件根據(jù)制造商說明書設定。首先，將100～200 ng DNA 樣本置于10 μL 含有1 ×DNA裂解緩沖液的反應體系中，98 ℃、5 min 變性裂解，然后將其與10 μL 含有2 μL 10 ×連接酶緩沖液、0.5 μL連接酶、1 μL 混合探針以及7.5 μL Mili-Q水的連接預混液充分混合。連接反應在ABI2720熱循環(huán)儀內(nèi)完成，采用以下反應條件:4個循環(huán)(94℃1 min，58 ℃4 h)，94 ℃2 min，溫度控制在4℃并且立即加入20 μL 2 ×終止緩沖液停止反應體系。每一個連接產(chǎn)物都采用2 ×48 位熒光PCR 反應擴增。PCR 反應體系為20 μL 混合液，其中包括1 ×PCR 預混液，1μL PCR 引物和1 μL 連接產(chǎn)物。PCR 反應體系為:95 ℃2 min，94 ℃20 s，9個循環(huán);65 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，94 ℃、20 s，25個循環(huán);57 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，60 ℃、1 h，最后恒溫在4 ℃。PCR 產(chǎn)物分離和檢測由毛細管電泳法在ABI3730XL 測序儀上檢測，原始數(shù)據(jù)分析和基因型判別由GeneMapper4.0 完成。

1.2.2 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件;單因素和多因素Logistic 回歸分析計算優(yōu)勢比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)判定CASP8 基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性的關(guān)系。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組有83例(97.6%)基因分型成功，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組有259例(95.9%)基因分型成功。CASP8 rs1035142 G＞T 三種基因型GG、GT、TT 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的頻率分布分別為31.3%、53.0%、15.7%和42.9%、40.9%、16.2%，組間比較無統(tǒng)計學差異(χ2=4.192，P=0.123)。單因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，以GG 基因型作為參照，攜帶CASP8 rs1035142 GT 基因型的食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險升高(OR=1.77，95%CI=1.02～3.08，P=0.04)。多因素Logistic 回歸發(fā)現(xiàn)，在調(diào)整了年齡、性別、吸煙及飲酒狀況后，攜帶GT 基因型的個體淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險依舊比攜帶GG基因型的個體高(調(diào)整OR=1.77，95% CI=1.02～3.09，P=0.04)。但這種變化并不與個體攜帶突變基因的個數(shù)呈劑量依賴效應，在結(jié)果中沒有發(fā)現(xiàn)突變純合TT 基因型與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險有相關(guān)性(P=0.49)。在顯性模型分析中，調(diào)整了年齡、性別、吸煙及飲酒狀態(tài)后，以CASP8 rs1035142 GG作為參照，GT +TT 基因型沒有明顯增加患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險(調(diào)整OR=1.64，95% CI=0.97～2.78，P=0.07)。隱性模型中調(diào)整了年齡、性別、吸煙及飲酒狀態(tài)后，相對于GG +GT 基因型，未發(fā)現(xiàn)CASP8 rs1035142 TT 基因型與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性存在關(guān)聯(lián)(調(diào)整OR=0.95，95% CI=0.48～1.88，P=0.89)。

3 討論

由于食管周圍存在復雜的淋巴系統(tǒng)，晚期食管鱗癌患者從頸部至腹腔都可以發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［6，7］?，F(xiàn)有的檢查技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)微小的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，無法準確判斷食管鱗癌患者的TNM 分期，從而影響了個體化治療方案的制定和實施。因此，亟需發(fā)現(xiàn)一種新型可靠的檢查方法來準確評估患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

Motoyama 等研究發(fā)現(xiàn)，急性反應蛋白1846 C＞T 基因多態(tài)性是食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性的獨立影響因素，攜帶突變基因型的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險顯著增加;將檢測該多態(tài)性位點和傳統(tǒng)檢查技術(shù)相結(jié)合，可使診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準確性大大提高。因此我們推想從遺傳學角度研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在機制，并從分子水平對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況作出評估，可以達到早期發(fā)現(xiàn)、個體化治療甚至預防淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的目的。

有文獻報道，在胃癌患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的CASP8 mRNA 和CASP8 蛋白的表達顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者［8］，而基因多態(tài)性可以影響基因的表達水平及蛋白酶的功能，我們猜測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制可能與CASP8的基因多態(tài)性有關(guān)。編碼CASP8的基因位于人類染色體2q33，由11個外顯子組成，在其29.68 kb 長度的DNA 雙鏈上存在1 000 多個突變位點，具有高度的多態(tài)性。Wu 等［9］發(fā)現(xiàn)，CASP8 rs1035142 位點多態(tài)性與食管腺癌的發(fā)生顯著相關(guān)。因此我們選擇了CASP8 rs1035142 G＞T 作為研究靶點，探討其與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性的關(guān)系。結(jié)果提示，CASP8 rs1035142 GT 基因型可增加食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險，可能是影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易感性的一個獨立因素。盡管本研究提示，CASP8基因多態(tài)性與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，CASP8 rs1035142 GT 基因型可能是食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的易感因素。但是本研究也存在不足之處，主要表現(xiàn)為:①除基因多態(tài)性外，RNA 干擾、基因甲基化和表達異常也可以引起CASP8 基因的低表達或不表達;②淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學過程很有可能是由多基因共同作用的結(jié)果;③未行單倍型分析，單基因位點并不能完全代表該基因區(qū)域的功能，單倍型分析對個體易感性評價更準確;④樣本量有限，統(tǒng)計學效能不高。因此，CASP8 基因多態(tài)性與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系還需對多態(tài)性位點進行多中心的大樣本研究。

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