羅 章，陳歷俊 ，陳歷水，周偉明

(1.西藏大學農(nóng)牧學院，食品科學學院，西藏林芝860000;2.北京三元食品股份有限公司，科研中心，北京100086;3.中糧營養(yǎng)健康研究院，食品研發(fā)中心，北京100020)

近年來，西藏當?shù)仃笈Ｈ榧鞍l(fā)酵乳制品中的微生物分布備受科研人員的關(guān)注，而且重點多集中在其中的乳酸菌和酵母菌的研究。乳酸菌是一群通過發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細菌總稱，是一類在缺少氧氣的環(huán)境中生長良好的兼性厭氧菌，這類細菌在自然界中分布極廣。與乳品有關(guān)的乳酸菌種屬主要有:乳桿菌屬 (Lactobacillus )、雙歧桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostocs)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和片球菌屬(Pediococcus)等。隨著食品科技的發(fā)展，消費者對口感和健康的需求日益增強，發(fā)酵乳制品中的酵母菌也受到了越來越多的關(guān)注，不斷有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌作為附屬發(fā)酵劑對乳制品發(fā)酵和成熟過程中的風味影響、抑制有害菌的生長及對人體的潛在益生作用等［1，3-5］，有些酵母菌還會對發(fā)酵乳制品提供有益作用，尤其對干酪的風味和質(zhì)構(gòu)形成起到了非常重要的作用。不僅能利用凝乳中的乳糖發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸，使凝乳的pH 有所升高，刺激有助于干酪成熟的細菌生長;而且還能產(chǎn)生胞外蛋白分解酶和脂肪分解酶，使干酪中可溶性含氮物和辛酸、癸酸等高級脂肪酸增加。酵母菌在發(fā)酵葡萄糖等單糖的過程中能產(chǎn)生CO2氣體，CO2氣體的產(chǎn)生為干酪形成孔狀結(jié)構(gòu)提供了必要條件［6］;同時，酵母菌還能抑制腐敗微生物和梭狀芽孢桿菌的生長［7］;產(chǎn)生多種水溶性維生素，提高乳制品的營養(yǎng);除此以外，酵母菌還具有預防和治療急性痢疾［8-9］、降低膽固醇［6］、抗輻射［10］和抗氧化［11］等益生活性。本文對西藏原料乳及發(fā)酵乳制品中的乳酸菌和酵母菌的分布情況進行了歸納整理，以期為相關(guān)的科研人員提供工作方便。

1 原料乳

原料乳是乳酸菌和酵母菌容易繁殖的小生境，是發(fā)酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的主要來源之一，很多發(fā)酵乳制品如Kefir、Viili 以及獲得原產(chǎn)地保護認證(ProtectedDesignation of Origin，PDO)的法國Cantal 干 酪、 Camembert 干 酪 和 意 大 利TomaPiemontese 干酪均以原料乳直接加工而成，其中的乳酸菌和酵母菌賦予了產(chǎn)品特殊風味和提升健康的品質(zhì)［12］。西藏的牦牛乳具有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和礦物質(zhì)含量高等特性，被稱為“天然濃縮乳”，是高原地區(qū)人民重要的食品和乳品加工原料，也是乳酸菌和酵母菌棲息地所在。有研究發(fā)現(xiàn)牦牛原料乳中含有乳酸菌、酵母菌等有益菌，這些有益菌含量隨著海拔高度的增加有所增加。由于牦牛均為散養(yǎng)，生活環(huán)境的衛(wèi)生情況較差，所以牦牛原料乳中的有害微生物太多，直接用生乳做成的乳制品較少，目前很少有研究對原料中有益微生物進行篩選鑒定［13］。

2 西藏曲拉

西藏曲拉(藏語，指奶渣)，是藏族牧民將牦牛乳經(jīng)過脫脂后(制酥油后)自然發(fā)酵使酪蛋白凝結(jié)風干而制成的一種白色或黃色硬制顆粒狀的干酪，是幾千年來傳統(tǒng)的藏族食品。西藏的曲拉是利用原料乳通過傳統(tǒng)工藝制作的，環(huán)境中的微生物在干酪發(fā)酵的過程中起著重要的作用。作為自然的或經(jīng)選擇后添加的發(fā)酵劑，乳酸菌是曲拉中最重要的菌群。藏族通常在夏季制作曲拉并添加酸奶，因此，曲拉不僅是藏族貯藏食品蛋白的重要手段，而且是某些地區(qū)制作酸奶的發(fā)酵劑。由于青藏高原地處中國西北地區(qū)，平均海拔4000m 以上。屬于特殊的生態(tài)學區(qū)域，具有生物的廣泛性和特殊性，從而對曲拉中的微生物區(qū)系和典型風味的形成產(chǎn)生一定的影響。有研究發(fā)現(xiàn)每克新鮮曲拉樣品中的乳酸菌落總數(shù)為103～107個，酵母菌的菌落總數(shù)為103～108個，其中乳酸菌在大多數(shù)曲拉樣品中為優(yōu)勢菌群［14］。

段宇珩［15］等人對藏族傳統(tǒng)乳制品曲拉中的微生物進行分析后發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)微生物主要是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性和兼性厭氧。曲拉的自然發(fā)酵過程受到乳桿菌(Lactobacillus)，乳球菌(Lactococcus)，有時也包括腸球菌(Enterococcus)的控制，并且這些菌在曲拉中占優(yōu)勢地位。通過生理生化分析后發(fā)現(xiàn)與其他種類干酪不同的是，曲拉中的大多數(shù)乳酸菌均屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)，占總數(shù)的 78%，而從曲拉中分離到的乳桿菌屬(Lactobacillus)僅占15%，并不是優(yōu)勢屬，腸球菌屬(Enterococcus)僅為7%，是次要的屬。此外，大多數(shù)分離得到的乳酸菌為異型發(fā)酵，占總數(shù)的70%以上。

西藏曲拉中的酵母菌具有豐富的生物多樣性，有研究發(fā)現(xiàn)西藏曲拉中酵母菌的總數(shù)在106～107cfu/g 之間，曲拉中的酵母菌平均數(shù)比云南乳餅樣品中的酵母菌要高34 倍，其中西藏曲拉的優(yōu)勢菌株為發(fā)酵畢赤氏酵 母 (Pichiafermentans ) 和 釀 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae)。

3 藏靈菇乳

3.1 藏靈菇乳的功能活性

藏靈菇乳是西藏地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品。藏靈菇發(fā)酵乳實質(zhì)上是利用藏靈菇作為一種天然發(fā)酵劑對牛奶進行發(fā)酵，這種發(fā)酵劑含有多種乳酸菌和酵母菌，也有部分醋酸菌。目前在世界各國的發(fā)酵乳制品中，有酵母菌參與的只有兩種，一種是kumiss(也稱koumiss)，另一種是開菲爾(kefir)。這類飲品由于其獨特的保健效果，在民間廣為流傳，據(jù)說長期飲用能增強人體免疫力、補充維生素、延緩衰老、消除疲勞，特別適合胃病、腎病和肝膽病患者。藏靈菇來源于西藏，是一種多菌種的復合體由數(shù)種乳酸菌、酵母菌和醋酸菌共生而成一種粒狀乳制品發(fā)酵劑菌體，呈乳白色、膠質(zhì)狀，外形酷似米粒，可在鮮乳中生長、分裂并將其特性傳給下一代以產(chǎn)生新粒，由于經(jīng)過長期在牛奶中培養(yǎng)，體積會增大很多，形狀如盛開的雪蓮，所以有人稱之為“西藏雪蓮”。其外觀、微生物組成及發(fā)酵特性與流傳于東歐高加索地區(qū)的開菲爾粒(kefir grain)類似，但前者源自我國雪域高原，它的研究與開發(fā)有獨到之處，具有知識產(chǎn)權(quán)。藏靈菇實質(zhì)上是一種開菲爾粒，藏靈菇乳也就是一種開菲爾。鮮乳經(jīng)過開菲爾粒發(fā)酵后，由于益生菌的代謝作用，鮮乳中的蛋白質(zhì)、脂肪及乳糖均不同程度發(fā)生了降解;其中脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸的含量均具有顯著增加，游離脂肪酸和揮發(fā)性脂肪酸含量也有所升高，這些大分子物質(zhì)的降解使蛋白質(zhì)和脂肪更易于消化吸收;而且大部分乳糖被水解，β- 半乳糖苷酶含量增加，適宜乳糖不耐者飲用［13］。

開菲爾中酵母菌的抑菌活性通常認為是通過代謝物乙醇、亞硫酸鹽實現(xiàn)，也有人認為是在代謝過程中分泌了一些毒素蛋白，這些毒素蛋白起到了殺死敏感微生物而顯示出較強的淬火毒素作用［16］。起初認為具有殺菌活性的酵母菌只對親緣關(guān)系密切的同種其它菌株有殺菌活性，后來逐漸發(fā)現(xiàn)它們對其它真核生物如絲狀菌屬也有抗性，甚至對細菌，如革蘭氏陽性菌、陰性菌和生長緩慢的結(jié)核分支桿菌都有抗性，而且對不相關(guān)的葡萄球菌、腸桿菌、綠膿桿菌和副溶血性弧菌等均有殺菌活性，在現(xiàn)有的嗜殺酵母菌中、Pichia 和Hansenula 的殺菌活性最強。酵母菌產(chǎn)生的殺菌毒素是一種糖蛋白，它由特定的質(zhì)粒編碼、毒素效應(yīng)與敏感微生物的胞壁受體結(jié)合，導致細胞內(nèi)pH 顯著下降、代謝抑制、細胞死亡?？梢娊湍妇谏L代謝過程中產(chǎn)生的有抗菌、抗病活性的物質(zhì)可能是乙醇、亞硫酸鹽、乳酸等有殺菌作用的小分子物質(zhì)、肽類及其他一些未知成分的抗菌素、殺菌毒素糖蛋白［17］。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，在開菲爾中，酵母菌不僅能產(chǎn)生B 族維生素，而且具有抗菌活性，尤其對肺結(jié)核分支桿菌的抑制作用明顯;酵母菌細胞表面還能通過甘露糖特異性反應(yīng)吸附腸內(nèi)細菌排出的腸毒素［2］。又有研究人員發(fā)現(xiàn)工業(yè)酵母菌里含有“嗜殺因子”，這種由酵母菌分泌的蛋白質(zhì)或糖蛋白混合物“嗜殺因子”對腸內(nèi)細菌有明顯的抑制作用，同時，其分泌的短鏈脂肪酸和其他的一些特殊的物質(zhì)也可以對腸道內(nèi)的有害菌起到抑制作用。發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸和二氧化碳成分則有改善口感，促進唾液分泌和腸道蠕動［18-19］等作用。

從我國傳統(tǒng)的西藏靈菇中已分離出高效降膽固醇的菌株KM-16。開菲爾因含有抑制癌細胞增殖的莢膜多糖，因此可降低癌癥發(fā)病率，有抗腫瘤作用。開菲爾還是一種增強機體免疫力的營養(yǎng)食物，被用于AIDS 病患者、慢性疲勞過度患者以及皰疹患者的飲食療法中。目前根據(jù)對其起療效作用的活性特質(zhì)、微生物形成的抑制致病菌的抗菌性物質(zhì)、抑制癌癥的發(fā)生和抑制癌細胞增殖物質(zhì)的研究，認為開菲爾確實是具有使人長壽、祛病延年的神奇飲料。開菲爾中的活性物質(zhì)可以降低血中的膽固醇水平以預防心血管疾病。

3.2 藏靈菇乳中的乳酸菌和酵母菌

藏靈菇有良好的發(fā)酵特性，它與傳統(tǒng)的酸奶或用其他純種乳酸菌發(fā)酵劑制成的產(chǎn)品有很大的不同，最顯著的特征是除乳酸發(fā)酵外，還伴有輕微的由酵母菌引起的酒精發(fā)酵，是一種集酸味、醇味為一體的新型發(fā)酵乳制品。經(jīng)研究表明，藏靈菇中主要的微生物是乳酸菌和酵母菌，其中乳酸菌主要包括乳桿菌和乳球菌，具體為開菲爾乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳酸乳球菌;酵母菌包括啤酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、單孢酵母，其中以耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、亞羅克魯維酵母(Yarrowia lipolytica)為主體酵母菌，以乳酸桿菌、短乳桿菌和乳酸鏈球菌等乳酸菌為主體細菌構(gòu)成的塊狀共生菌系，以酵母假絲和營養(yǎng)體構(gòu)成菌塊中心，有乳酸菌分布在菌塊外周部分共同完成復雜的牛乳發(fā)酵分解過程;也有報道含有醋酸菌、雙歧桿菌等，菌落數(shù)與采樣的地域不同、海拔不同而差異很大。通過對藏靈菇進行電鏡掃描發(fā)現(xiàn)藏靈菇內(nèi)層菌群密度比外層小，以彎曲桿菌為主，還有部分橢圓形酵母，外側(cè)菌群密度較大，絕大部分是短桿菌，同時還有部分酵母菌分布在表層［20］。

開菲爾發(fā)源地是在高加索地區(qū)，后逐漸在前蘇聯(lián)、東歐、中東、西德、瑞士和北歐等地傳播，近年來在美、英、加拿大以及日本等國開始普及，開菲爾不僅具有一般飲料所沒有的爽口感和風味，而且在營養(yǎng)上屬于低熱值低糖富含蛋白質(zhì)和維生素的優(yōu)質(zhì)飲品，并對胃腸疾病代謝系統(tǒng)疾病高血壓局部貧血心臟病和過敏癥等疾病也有良好的治療作用。正由于其獨特的風味特點以及營養(yǎng)生理和保健功效，開菲爾的研究開發(fā)和生產(chǎn)越來越受到人們的關(guān)注。開菲爾最典型的發(fā)酵劑是通過開菲爾粒在乳中生長制得的，開菲爾粒的基本微生物菌叢是乳酸菌、酵母菌和醋酸菌。它們分布在粒子不同的層次上，一般酵母菌分布在粒子的外表層，而乳酸菌和醋酸菌分布在內(nèi)部。開菲爾中的乳酸菌主要包括乳球菌屬、乳桿菌屬和明串珠菌屬;酵母菌包括乳糖發(fā)酵型和乳糖非發(fā)酵型兩類，前者包括乳酸酵母、脆壁酵母、乳酸克魯維酵母、乳酒假絲酵母等;后者包括啤酒酵母、德氏酵母等;醋桿菌是開菲爾中唯一的醋酸菌［21］。

陳芝蘭等［22］通過對西藏牧民家庭制作的牦牛發(fā)酵乳制品中酸奶和奶渣的微生物數(shù)量進行分析，采用傳統(tǒng)分類與16SrRNA 基因序列測定的方法對分離的乳酸菌進行鑒定。發(fā)現(xiàn)3 份發(fā)酵牦牛乳樣品中乳酸菌數(shù)為1.04 ×104～2.10 ×106CFU/mL，酵母菌數(shù)為8.20 ×103～6.70 ×105CFU/mL;共分離15 株乳酸桿菌、4 株乳酸球菌和3 株酵母;乳酸菌中10 株為Lactobacillus paracasei、1 株Lactobacillu fermentum、2株Lactobacillus reuteri、1 株Lactobacillus brevis、1 株Lactobacillus delbrueckii sp.bulgaricus、2 株P(guān)ediococcus acidilactici、另有Pediococcu 和Lactococcus 各1 株，未鑒定到種;L.paracasei 為牦牛發(fā)酵乳制品中乳酸菌的優(yōu)勢種(占總分離株的55.6%)。艾日登才次克［14］采用形態(tài)學觀察、生理生化實驗、糖發(fā)酵實驗、乳酸旋光性測定等傳統(tǒng)鑒定方法與16S rDNA 序列同源性分析相結(jié)合的方法對44 份發(fā)酵乳樣品中分離出122株乳酸桿菌和49 株乳酸球菌，進行鑒定，結(jié)果卻不一樣，其中 Lactobacillus fermentum 和 Lactobacillus casei 是最常見的菌株，分別占總分離株的29.9%和26.9%。其次為 Lactococccus lactis sp. lactis 和Lactobacillus plantarum，同時還分離出了Lactobacillus helveticus、Lactobacillus curvatus、Enterococcus duarus、Enterococcus faecium、Lactococccuslactis sp. cremoris、Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides、Leuconosto cpseudome-senteroides、Lactococccus garvieae。

有研究人員從藏靈菇乳中分離篩選出8 種乳酸菌和5 種酵母菌，即乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌、開菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌和馬克斯克魯維酵母為純培養(yǎng)發(fā)酵劑的組合菌。有對比實驗發(fā)現(xiàn)西藏開菲爾粒中的乳桿菌的數(shù)目和種類要多于乳球菌，且大部分為短桿菌，而俄羅斯地區(qū)的開菲爾粒中的主要微生物則是乳球菌的數(shù)量是最多的，其次是鏈球菌、乳桿菌，同保加利亞地區(qū)的開菲爾粒在菌相分布上有相似性。實驗結(jié)果顯示，從開菲爾粒中分離的乳酸菌都具有凝乳能力，但是凝乳時間凝乳質(zhì)地差異顯著，另外各菌株間的半乳糖苷酶活性的差異也比較顯著。另外，開菲爾粒中的酵母菌還是重要的益生菌來源，從開菲爾粒分離出耐酸、耐膽鹽和耐高溫，發(fā)酵性能良好的開菲爾假絲酵母，及高產(chǎn)葉酸的假絲酵母和釀酒酵母［23］。西藏開菲爾發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中乳酸菌與酵母菌的增殖具有不同的發(fā)展趨勢，發(fā)酵前期(0～3h)，開菲爾粒中的微生物連續(xù)快速地進入牛乳，形成初始菌系，在牛乳中不斷增殖，乳酸菌在發(fā)酵過程中生長較快，數(shù)量較多，酵母菌生長較慢，數(shù)量相對較少，具體而言，發(fā)酵前期，氧氣供應(yīng)較為充分，酵母菌在這種弱酸性條件下，逐步適應(yīng)環(huán)境，生長緩慢，乙醇增加緩慢;其后(6～16h)，酵母菌完全適應(yīng)了周圍環(huán)境而不斷生長，并利用乳糖半乳糖和葡萄糖進行厭氧發(fā)酵，開始產(chǎn)生大量的乙醇，此外，發(fā)酵過程中乳酸菌代謝產(chǎn)生的丙酮酸等物質(zhì)也會被酵母菌直接利用，從而進一步加快酵母菌的生長繁殖及提高乙醇的產(chǎn)率。20h 后，發(fā)酵乳的營養(yǎng)物質(zhì)消耗將盡，菌體生長達到穩(wěn)定期，發(fā)酵乳的酸度也達到穩(wěn)定趨勢［24］。

4 小結(jié)

隨著消費者對發(fā)酵食品保健功能的認識越來越深刻，西藏牦牛原料乳及發(fā)酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的研究成為廣大科研工作者的研究熱點，其中包括乳酸菌和酵母菌的菌種篩選、鑒定以及發(fā)酵乳制品新的保健功能的發(fā)現(xiàn)和保健功能機理的探索，但是這些研究目前大多數(shù)還在理論研究階段，還缺乏系統(tǒng)的與工業(yè)化相結(jié)合的研究。因此，科研院所聯(lián)合相關(guān)企業(yè)利用西藏乳及發(fā)酵乳中篩選得到的一系列益生菌株進行深入研究，并將這些有益的菌株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中，包括乳制品中、肉制品及其他的發(fā)酵食品中，實現(xiàn)產(chǎn)學研一體化將是今后的主要發(fā)展方向，從而達到實現(xiàn)真正意義上的以科研服務(wù)企業(yè)、服務(wù)消費者。

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