陳 冰，陳 陽，閆宜峰，陶香香，何 雷(皖南醫(yī)學院病理教研室，蕪湖 400;皖南醫(yī)學院法醫(yī)學系;弋磯山醫(yī)院病理科)

心源性猝死一直是法醫(yī)學死因判定上的難點，而急性心肌缺血猝死心肌的病理組織學診斷是法醫(yī)工作者診斷心源性猝死的關(guān)鍵所在?，F(xiàn)代病理學技術(shù)的發(fā)展，為急性心肌缺血猝死心肌的病理組織學診斷提供了較為客觀的檢查方法和觀察指標。HE染色在心肌缺血6－12 h后發(fā)現(xiàn)病變，已被大多數(shù)學者認可，但這些病理變化的特異性還有待進一步探索。特殊組織學染色是一種比較實用的診斷心肌缺血的方法，可以作為常規(guī)技術(shù)廣泛應用于法醫(yī)實踐工作中，Nagar-Olsen染色(蘇木精堿性復紅苦味酸法)、Heidenhain染色(鐵礬-蘇木素－伊紅染色)，文獻報道都可用在心肌缺血的早期診斷中。劉英坤等［1］研究報道Heidenhain染色方法可在早期缺血的心肌纖維出現(xiàn)明顯的反應，胡志紅等［2］進一步驗證和揭示了Heidenhain染色方法的應用價值，也有部分學者采用Nagar-Olsen染色進行心肌缺血的早期診斷［3］。Heidenhain氏蘇木精法染色在操作流程中有別于Heidenhain染色，且用于心肌缺血的早期診斷鮮見報道。

為了探討準確的組織學染色方法對法醫(yī)檢案實踐中的診斷及鑒別的幫助作用，進一步確定Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精法染色在急性心肌缺血猝死鑒定中的應用價值，本文采用HE染色、Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色(鐵礬－蘇木素－伊紅染色)和Heidenhain氏蘇木精法染色對28例急性心肌梗死心肌、10例冠心病非心源性猝死心肌進行染色，并設10例正常心肌對照組作比較性研究，以便尋找到簡易可行，結(jié)果可靠的染色方法。

1 材料和方法

1.1 材料

所有標本均選自我院法醫(yī)鑒定中心2009－2012年來受理的法醫(yī)病理學檢驗案例。死者年齡20－65歲。根據(jù)尸體解剖及HE染色結(jié)果，并結(jié)合法醫(yī)鑒定書，分為3組:①28例急性心肌梗死組，冠狀動脈狹窄均為Ⅲ－Ⅳ級，HE染色可見心肌梗死，經(jīng)全面尸檢排除其他死因。②10例冠心病非心源性猝死組，冠狀動脈狹窄為Ⅰ－Ⅳ級，肉眼及HE染色均未見心肌梗死病灶。③10例對照組，生前均無心臟病史，解剖也未發(fā)現(xiàn)有心臟器質(zhì)性病變，死因為顱腦外傷或機械性損傷。

1.2 染色方法

1.2.1 HE染色 常規(guī)脫水，浸蠟，包埋、石蠟切片脫蠟至水;蘇木素染色;分化;伊紅染色;脫水、透明、封片。

1.2.2 Nagar-Olsen染色 ①石蠟切片脫蠟至水;②浸入Nagar-Olsen氏蘇木精溶液10－20 s;③流水沖洗5 min;④0.1%堿性復紅水溶液3 min;⑤蒸餾水洗5－10 s;⑥純丙酮5－10 s;⑦0.1%苦味酸－丙酮溶液分化至無色，約20 s;⑧二甲苯透明，樹膠封固。

1.2.3 Heidenhain染色(鐵礬－ 蘇木素－ 伊紅染色) ①石蠟切片脫蠟至水;②媒染于5%鐵礬液內(nèi)5－7 min，水洗30 s;③蘇木素液中染5－7 min，流水沖洗5 s;在鐵礬液中分色(鏡下控制到正常心肌纖維為無色為止)，流水沖洗5 min;⑤各級乙醇脫水至95%乙醇時，酸溶液伊紅復染;⑥脫水、透明、樹膠封片。

1.2.4 Heidenhain氏蘇木精法染色 ①石蠟切片脫蠟至水;②5%硫酸鐵銨水溶液中媒染60 min;③蒸餾水急洗5－10 s;④放入Heidenhain氏蘇木精溶液內(nèi)60 min;⑤以5%硫酸鐵銨水溶液與蒸餾水1∶1稀釋分化并流水沖洗交替進行(鏡下控制);⑥流水沖洗10 min;⑦脫水、透明、樹膠封片。

1.3 判定標準

三種組織化學染色方法結(jié)果判定標準見表1。

HE染色結(jié)果判定標準:正常心肌纖維染色為粉紅色，胞質(zhì)、胞核顯示清晰，細胞膜完整，細胞排列規(guī)則，細胞間隙適中。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0軟件包進行分析，各組間陽性率比較采用χ2檢驗。各種方法比較采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果

對48例標本均進行了HE染色，對照組心肌纖維染色為粉紅色，胞質(zhì)胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰;急性心肌梗死組梗死區(qū)心肌纖維凝固性壞死、核碎裂、消失，胞質(zhì)均呈不規(guī)則粗顆粒狀，間質(zhì)水腫，有少量中性粒細胞浸潤(圖1)，冠狀動脈Ⅲ－Ⅳ級狹窄，部分區(qū)域可見鈣化灶(圖2);冠心病非心源性猝死組，心肌纖維染色為粉紅色，胞質(zhì)胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰，冠狀動脈Ⅰ－Ⅳ級狹窄，均未見梗死灶。HE染色顯示只有在梗死區(qū)才會出現(xiàn)細胞核的改變，在非梗死區(qū)心肌纖維表現(xiàn)為細胞水腫，胞質(zhì)紅染，胞核無明顯病變，與對照組心肌很難鑒別。

2.2 Nagar-Olsen 染色結(jié)果

Nagar-Olsen染色顯示對照組心肌呈淺棕色，無艷紅的缺氧心肌存在(圖3);急性心肌梗死組在梗死區(qū)周圍可見心肌呈艷紅色，呈灶狀或片狀分布(圖4);非心源性猝死組大部分心肌呈淺棕色，其中有2例在邊緣區(qū)出現(xiàn)艷紅色。

2.3 Heidenhain 染色結(jié)果

Heidenhain染色顯示對照組心肌呈紅色，無黑色的缺氧心肌存在;急性心肌梗死組梗死區(qū)大部分心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑點，呈灶狀或片狀分布(圖5);非心源性猝死組有1例在心外膜下心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑點，呈點狀分布。

2.4 Heidenhain氏蘇木精法染色結(jié)果

Heidenhain氏蘇木精法染色顯示，對照組心肌呈棕黃色，心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)未見黑點;急性心肌梗死組，梗死區(qū)大部分心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑點，呈灶狀或片狀分布(圖6)，胞核也呈黑色;非心源性猝死組也有1例在心外膜下心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了黑點。

2.5 不同染色方法在各組表達的結(jié)果

表2結(jié)果顯示Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色在急性心肌梗死心肌組中陽性表達率分別為75%，54%和50%;在冠心病非心源性猝死心肌中陽性表達率分別為20%，10%和10%;在正常心肌組表達均呈陰性。上述三種方法在以上兩組的陽性表達率比較未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但急性心肌梗死心肌組與非心源性猝死組及對照組陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討論

猝死(sudden death)是由于機體潛在的疾病或重要器官急性功能障礙導致的意外突然的死亡。由于猝死發(fā)生時的意外性和突然性，且多無醫(yī)生在場，易引起懷疑，故需經(jīng)法醫(yī)解剖鑒定死因［4］。據(jù)我國猝死資料統(tǒng)計分析，心血管疾病猝死大約占50%－60%，居猝死發(fā)生率之首［5］。其中冠心病是心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)生猝死最常見的疾病。對于冠心病猝死的法醫(yī)學鑒定，特別要注意尋找心肌缺血性改變，尤其要注意尋找早期心肌缺血的改變。所以，判定早期的心肌缺血，對心源性猝死的法醫(yī)學鑒定具有重大的實際意義。

雖然急性心源性猝死的早期病理改變常規(guī)組織病理學檢查有時難以發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變，但我們對各組均進行了HE染色，旨在確定梗死區(qū)的范圍和觀察梗區(qū)邊緣心肌缺血的病理變化。同時觀察到細胞核的改變主要出現(xiàn)在明顯的梗死區(qū)內(nèi)，而在非梗死區(qū)心肌纖維的表現(xiàn)在三組中無明顯差別。因此HE染色在觀察早期心肌缺血方面應以胞質(zhì)的變化為主。

尋找更敏感的染色方法，并用于法醫(yī)實踐中，對鑒別和診斷早期心肌缺血具有重要的意義。特殊染色具有價格便宜、操作簡便易行、結(jié)果準確、靈敏等優(yōu)點，不失為一種有價值的診斷早期缺血的方法，心肌早期缺血改變與正常心肌對某些色素的著色性質(zhì)不同而呈現(xiàn)不同的色調(diào)，因而可以顯示和判定心肌早期缺血的變化。目前，主要常用于心肌缺血診斷的組織學染色方法有Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色等［6］。而Heidenhain氏蘇木精染色也是一種傳統(tǒng)的染色方法，通常是用于一些較薄的組織的回染。特別是用于細胞核的染色觀察，能夠清楚地顯示染色體、染色質(zhì)以及細胞質(zhì)中線粒體的位置。此外，還可以使髓鞘染色，用于心肌早期缺血判定鮮見報道。

目前對于這些方法的研究，文獻表明主要是采用其中的一種與HE染色進行比較，而且往往是用于動物實驗［7］。因此本研究對上述三種染色方法進行了比較性研究，本研究發(fā)現(xiàn)，與HE染色比較，在部分HE顯示相對正常的區(qū)域，Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色都提示有缺氧的心肌的存在;而且急性心肌梗死組與非心源性猝死組及對照組陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，證實了這三種染色方法在急性心源性猝死的診斷上都具有應用價值。

研究還顯示Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色雖然方法不同，操作步驟不一樣，但結(jié)果基本一致(P＞0.05)，且在急性心肌梗死組中，Heidenhain氏蘇木精染色強陽性率為50%(14/28)，顯著高于Heidenhain染色的強陽性率18%(5/28)。文獻中大多采用的是 Heidenhain染色［8］。其中 Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色經(jīng)過我們反復實驗，表明在早期缺氧心肌中顯示為細胞質(zhì)中出現(xiàn)黑點，病變的部位主要在心內(nèi)膜下(血管供應末端)、心肌細胞膜及橫紋處(功能代謝強)，并未出現(xiàn)文獻報道的心肌染為黑色［2］。同時，Nagar-Olsen染色的陽性率(75%)較高，該染色方法較其他兩種方法在操作分化時較容易控制有關(guān)，但強陽性數(shù)不足，可能與Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色中的蘇木素液與其配制方法不同有關(guān)。Nagar-Olsen染色在梗死區(qū)周圍的心肌顯示為明顯的艷紅色并大致勾勒出壞死的邊緣，有助于確定梗死區(qū)的范圍及面積。

研究結(jié)果顯示，單獨使用 Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色法在顯現(xiàn)早期心肌缺血方面有可能出現(xiàn)假陽性或假陰性(若對操作流程中的技術(shù)不熟練，分化掌握不好時易出現(xiàn))。因此，我們建議采用HE染色結(jié)合Nagar-Olsen染色方法，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性，并且有助于確定梗死區(qū)的范圍及面積;或采用HE染色結(jié)合Heidenhain氏蘇木精法染色，強陽性率較高，有助于急性心源性猝死診斷的準確性。

免疫組化雖也能發(fā)現(xiàn)早期的心肌缺血性改變，但是該方法試劑價格昂貴，實驗條件要求較高，操作技術(shù)性強，不宜在基層廣泛開展。而組織化學染色，實驗試劑價格低廉、易操作，只要嚴格按操作步驟操作，避免假陽性的發(fā)生，在基層宜推廣。因此，在心肌早期缺血法醫(yī)學鑒定過程中，采用HE染色結(jié)合Nagar-Olsen染色或HE染色結(jié)合Heidenhain氏蘇木精法進行檢測具有重要的實用價值。

［1］ 劉英坤，鐘志，班翔，等.診斷早期心肌缺血三種組織學染色方法的比較［J］.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2002，36(3):238.

［2］ 胡志紅，王庭，吳萍.心肌Heidenhain染色在冠心病猝死診斷中的應用觀察［J］.九江學院學報，2011，92(1):46－47.

［3］ 李建宇，李怡，龔海英，等.蕨麻正丁醇提取部位對小鼠急性心肌缺血損傷的保護作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合學報，2009，7(1):48－52.

［4］ 邵同先，張?zhí)K亞.不同組化染色對實驗性急性心肌缺血的早期診斷研究［J］.陜西醫(yī)學雜志，2005，34(4):443－445.

［5］ 張海娥，賀衛(wèi)東.116例尸體解剖的臨床病理分析［J］.中國臨床醫(yī)學，2004，11(6):1111－1114.

［6］ 孟祥艷，孫慧燕，孔麟麟，等.鋅指基因ZFP580在大鼠心肌缺血損傷中的表達［J］.武警醫(yī)學院學報，2010，19(1):1－3.

［7］ 張新寧，呂琪，張永亮.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改進［J］.武警醫(yī)學院學報，2008，17(11):941－942.

［8］ 李凡，馬淑玲，莫耀南，等.心肌特殊染色在冠心病猝死診斷中的應用研究［J］.河南科技大學學報:醫(yī)學版，2003，21(4):264.