姚 紅，郭海秀，劉慧榮

(1山西醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室，太原 030001;2山西醫(yī)科大學生理學教研室;3首都醫(yī)科大學病理生理學教研室;*通訊作者，E-mail:liuhr2000@126.com)

心力衰竭(簡稱心衰，HF)是多種心血管疾病發(fā)展到嚴重或終末階段的病理生理狀態(tài)，是全球范圍內(nèi)造成死亡的重要原因［1］。近20余年間，心衰患者體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了抗 β1/β2腎上腺素受體(β1/β2-AR)抗體、抗肌球蛋白抗體、抗M2膽堿能受體抗體等一系列抗心肌自身抗體，他們對心肌造成損害作用的研究亦在逐步深入。新近本研究小組證實，心衰患者體內(nèi)還存在β3腎上腺素受體自身抗體，且其具有受體激動劑樣效應，可影響心肌細胞的生物效應［2，3］。這些證據(jù)強烈提示，自身免疫損傷可能在心衰發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。但有關心肌自身抗體的產(chǎn)生機制卻鮮見報道。

心肌重塑被認為是心衰發(fā)生機制中的分子細胞學基礎。隨著心衰發(fā)展過程中心肌重塑不斷加重，推測心肌細胞抗原數(shù)量及分布位置可能發(fā)生改變，從而促進自身抗體的產(chǎn)生。本研究通過腹主動脈縮窄法制備心力衰竭大鼠模型，分析大鼠外周血β3AR自身抗體和心肌β3AR表達水平，探討心衰發(fā)生發(fā)展過程中β3AR自身抗體的產(chǎn)生和心肌重塑的關系，以期為心衰發(fā)病過程中自身抗體的產(chǎn)生機制提供試驗證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

純種健康雄性Wistar大鼠(由山西醫(yī)科大學動物中心提供)，10周齡，體重 200－250 g，按隨機數(shù)字表隨機分為2組:①心衰模型組(HF組，n=80):實施腹主動脈縮窄術;②偽手術對照組(sham組，n=40):僅分離腹主動脈而不結扎縮窄，其他操作與心衰模型組相同。

1.2 主要儀器和試劑

全波長掃描型酶標儀(美國Molecular Devices公司);RM6240 B型多道生理記錄儀(四川成都儀器廠);β3AR抗原肽段由西安美聯(lián)生物工程公司合成;大鼠β3AR特異性抗體購自Santa Cruz公司。

1.3 主要方法

1.3.1 慢性心力衰竭模型的建立 10%水合氯醛(400 mg/kg體重)腹腔麻醉，常規(guī)備皮消毒，逐層打開腹腔，左側腎動脈上方游離腹主動脈長約1 cm，與腹主動脈平行放置7號鈍針頭，將兩者一同結扎，腎出現(xiàn)缺血外觀，抽出針頭，使腹主動脈部分縮窄，狹窄處內(nèi)徑約0.7 mm。大鼠在30℃條件下蘇醒。偽手術組僅開腹分離腹主動脈，穿線不結扎。

1.3.2 大鼠血流動力學指標檢測和心臟標本分析

分別于手術后4，8，12和16周隨機選取實驗大鼠(HF組n=8，sham組n=6)稱量體重后，用25%烏拉坦麻醉，經(jīng)右側頸總動脈插入心導管至左心室，記錄左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大收縮率(+d p/d tmax)和最大舒張率(－d p/d tmax)。測定結束后，迅速取出心臟，沿冠狀面將心臟分為兩部分，一部分置于10%中性福爾馬林固定48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作4μm組織切片，采用Masson和HE染色于光學顯微鏡下觀察心肌形態(tài);一部分低溫保存，用于心肌細胞β3AR測定。

1.3.3 心肌細胞β3AR含量測定 采用蛋白免疫印跡技術(Western blot)測定大鼠左心室組織β3AR含量。心肌組織蛋白提取按照膜相/水相蛋白提取試劑盒(TansMem protein isolation system instructions，Applygen Technologies Inc)說明書操作。蛋白含量采用BCA法測定。30μg變性蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離后轉膜，分別與大鼠β3AR特異性抗體及二抗孵育，采用化學發(fā)光法測定結果。

1.3.4 大鼠血清中β3AR自身抗體的測定 分別于術前及手術后4周，8周，12周和16周采用剪尾法收集大鼠血液，2 500 r/min離心，分離血清，應用ELISA方法檢測 β3AR自身抗體［4］。主要步驟如下:以1μg/ml人工合成β3AR細胞外第二環(huán)肽段作為包被抗原，按每孔50μl包被96孔ELISA板，5%小牛血清的磷酸鹽緩沖液封板;將待測血清以1∶10稀釋于PMT溶液中，以每孔50μl加于 ELISA板，37℃水浴1 h，棄去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次間隔5 min，空干;將生物素化山羊抗大鼠IgG(Sigma)按1∶3 000稀釋于PMT溶液中，以每孔50 μl加于ELISA板，37℃水浴1 h，棄去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次間隔5 min，空干;將標記有辣根過氧化物酶的鏈霉親和素SA-HRP(Sigma)以1∶4 000的濃度稀釋于PMT溶液中，以每孔50μl加于ELISA板，37℃水浴1 h，棄去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次間隔5 min，空干;將新鮮配制的底物ABTS(2 mmol/L)與H2O2(2.5 mmol/L)的混合液以每孔50μl加于ELISA板，37℃水浴30 min;利用酶標儀波長λ=405 nm讀取各孔的光密度值(optical density，OD)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠血流動力學指標變化

實施腹主動脈狹窄術后8周，HF組大鼠的LVSP和±d p/d t max均低于sham組，LVEDP高于偽手術組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);術后12和16周，心功能障礙無進一步加重的趨勢，但與同期偽手術組相比，各參數(shù)仍有明顯的差異(P＜0.05，見表1)。提示心衰大鼠模型建立成功。

2.2 大鼠心肌形態(tài)學改變

Masson和HE染色結合光學顯微鏡觀察及圖像分析技術顯示，HF組大鼠隨著時間的推移，心肌發(fā)生了多病灶的變性病變，伴有淋巴細胞浸潤;心肌組織發(fā)生明顯的膠原纖維化(圖1，見第165頁)。

2.3 心衰模型形成過程中，心肌細胞β3 AR的含量改變

與同期sham組大鼠相比，HF組大鼠心肌細胞β3AR含量在術后4周已有輕微增加，但差異尚無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在術后8，12 和16周，β3AR的含量一直維持在較高的水平，與同期sham組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見圖2)。

2.4 大鼠血清中β3AR自身抗體的產(chǎn)生和變化規(guī)律

術后4周，HF組大鼠血清中β3AR自身抗體水平(A值)較同期sham組增高(P＜0.05);術后8周時上升達峰值，保持至12周。術后16周，HF組大鼠血清中β3AR自身抗體下降，較同期sham組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見圖3)。

3 討論

β腎上腺素受體(βAR)是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要成員，在調(diào)節(jié)心臟活動中發(fā)揮著重要的作用。以前認為，心臟僅表達β1AR和β2AR兩種亞型，發(fā)揮心肌正性變時、變力和變傳導效應。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人類等多種種屬動物的心肌細胞中也有β3AR的表達，介導心肌負性變力效應。Moniotte等［5］發(fā)現(xiàn)，心衰患者心肌β3AR表達水平較正常人上調(diào)2－3倍，而且與之偶聯(lián)的Gi蛋白也上調(diào)。起搏引發(fā)的狗心臟衰竭［6］及異丙腎上腺素誘導的大鼠心衰模型［7］也發(fā)現(xiàn)了心肌β3AR上調(diào)。本研究采用腹主動脈縮窄增大左心負荷的方式成功建立大鼠心力衰竭模型，大鼠在手術處理8周之后，LVEDP升高，±d p/dtmax顯著下降，出現(xiàn)心肌細胞肥大、心肌纖維化等心肌重塑表現(xiàn)，同時證實心衰大鼠心肌β3AR的表達明顯增高，并在心衰發(fā)展過程中持續(xù)處于高水平表達。提示心衰時β3AR的激活可能在心臟活動的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，并且推測心衰時心肌重塑，心肌細胞β3AR抗原數(shù)量的改變，可能會激活自身反應性淋巴細胞，促發(fā)相應自身抗體的產(chǎn)生。

本研究進一步采用人工合成β3AR細胞外第二環(huán)肽段作為包被抗原，運用ELISA技術檢測發(fā)現(xiàn)，心衰大鼠血清中出現(xiàn)了高滴度的β3AR自身抗體。在心衰過程中隨著心臟病理變化的發(fā)展，該抗體呈現(xiàn)一種產(chǎn)生、增強、維持和自然消退的自我消長變化規(guī)律，也就是說，在沒有任何附加干擾因素條件下，單純心力衰竭的病理變化就能引發(fā)β3AR自身抗體的產(chǎn)生。分析β3AR自身抗體和心肌β3AR表達的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在術后4周大鼠心肌β3AR含量開始升高時，血清中β3AR自身抗體亦出現(xiàn)較高的滴度;在術后8周后心肌β3AR含量達高峰并持續(xù)高含量表達時，血清中相應自身抗體的含量也達到高峰，并保持了一定的時程;但在術后16周時，盡管心衰大鼠心肌β3AR依舊高表達，但其血清中β3AR自身抗體已經(jīng)回落，甚至消失。此結果提示，心衰發(fā)生時心肌重塑β3AR表達增高可能是促進β3AR自身抗體產(chǎn)生的因素之一，但在心衰發(fā)展過程中還有其他因素參與了抗β3AR自身抗體的調(diào)節(jié)，值得我們進一步研究。

［1］Rosamond W，F(xiàn)legal K，F(xiàn)urie K，etal.Heart disease and stroke statistics-2008 update:a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee［J］.Circulation，2008，117(4):e25－e146.

［2］姚紅，郝素珍，趙榮瑞，等.不同原發(fā)疾病所致心衰患者中β3－腎上腺素受體自身抗體的檢測意義［J］.中國預防醫(yī)學雜志，2008，9(10):875－878.

［3］李美霞，王曉樑，湯嘉寧，等.心力衰竭患者抗β3腎上腺素能受體自身抗體的分布及特性［J］.中華心血管病雜志，2005，33(12):1114－1118.

［4］姚紅，李強，武燁，等.心力衰竭發(fā)展過程中β3腎上腺素受體自身抗體的產(chǎn)生及意義［J］.中國藥物與臨床，2011，11(5):492－496.

［5］Moniotte S，Balligand J.Potential use of beta(3)-adrenoceptor antagonists in heart failure therapy［J］.Cardiovasc Drug Rev，2002，20(1):19－26.

［6］Morimoto A，Hasegawa H，Cheng H，etal.Endogenous beta3-adrenoreceptor activation contributes to left ventricular and cardiomyocyte dysfunction in heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286(6):H2425－H2433.

［7］Zhang Z，Cheng H，Onishi K，etal.Enhanced inhibition of L-type Ca2+current by beta3-adrenergic stimulation in failing rat heart［J］.JPharmacol Exp Ther，2005，315(3):1203－1211.