王明芹（綜述），許卓文（審校）

（1.武警河北總隊醫(yī)院門診部，河北石家莊050081；2.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社臨床薈萃編輯部，河北石家莊050017）

·綜 述·

耐藥性結(jié)核快速診斷的研究進展

王明芹（綜述）1，許卓文（審校）2

（1.武警河北總隊醫(yī)院門診部，河北石家莊050081；2.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社臨床薈萃編輯部，河北石家莊050017）

結(jié)核；抗藥性；診斷技術(shù)和方法；綜述文獻

2007年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計初治肺結(jié)核患者中，耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDRTB）占2.9％，復(fù)治患者中，MDR-TB占15.3％，耐藥與既往治療密切相關(guān)，任意耐藥的比例可能要高出未治療患者4倍，MDR-TB可能要高出10倍。全球每年新出現(xiàn)30～60萬MDR-TB患者，其中24％在中國［1］。我國衛(wèi)生部2010年4～7月組織全國31省、自治區(qū)、直轄市開展的第5次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查也顯示，我國肺結(jié)核患者耐多藥率為6.8％，根據(jù)本次調(diào)查估算的我國現(xiàn)有的患者數(shù)，MDR-TB患者為33.9萬，廣泛耐藥患者為10.5萬，與其他國家相比仍十分嚴重［2］。MDR-TB的產(chǎn)生直接影響到化療的失敗，MDR-TB已經(jīng)成為了結(jié)核病防治中的一大難題，現(xiàn)將耐藥結(jié)核的定義、快速診斷的研究進展綜述如下。

1 耐藥結(jié)核的定義

全國多耐藥結(jié)核病學(xué)術(shù)會議（1997年9月15—18日廈門）將MDR-TB定義為對異煙肼（H）、利福平（R）、比嗪酰胺（Z）、乙胺丁醇（E）、鏈霉素（S）5種主要抗結(jié)核藥中任何2種及2種以上產(chǎn)生耐藥者。考慮到耐HR在臨床上的重要性，建議單獨統(tǒng)計至少已經(jīng)耐HR的情況。過去對MDR-TB的譯名也比較混亂，有“多種耐藥結(jié)核病”、“多重耐藥結(jié)核病”等，經(jīng)會議討論，認為“耐多藥結(jié)核病”一詞比較貼切，其他相關(guān)名詞統(tǒng)一為“耐多藥結(jié)核分枝桿菌”、“耐多藥菌株”、“耐多藥病例”等。自1998年始，《中華結(jié)核和呼吸雜志》統(tǒng)一采用上述名詞［3］。

2 顯微鏡觀察藥物敏感性檢測（m icroscopic observation drug susceptib ility，MODS）技術(shù)

傳統(tǒng)的結(jié)核菌耐藥檢測方法需時較久，普通的培養(yǎng)加藥敏試驗需要2個月時間，遠不能滿足診治的需求，檢測患者結(jié)核菌的耐藥譜是治療的必要條件，早期得到耐藥信息對治療更有意義。MODS是近幾年發(fā)展起來的一種新的結(jié)核病病原學(xué)診斷方法，此方法2000年由Cavieds建立，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌在液體培養(yǎng)基上形成特征性索狀結(jié)構(gòu)的特性，將痰、胸腔積液、腦脊液標本直接接種在液體培養(yǎng)基中，一般采用24孔細胞培養(yǎng)板，先在24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入MODS培養(yǎng)基，然后取標本重懸液接種于培養(yǎng)板中，每個樣本設(shè)陰性對照（液體培養(yǎng)基）、陽性對照（MTU標準菌株H37Rv）。標本孔再分別加入異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇等抗結(jié)核藥，經(jīng)37℃、10％CO2的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每天觀察1次。在倒置顯微鏡下觀察索狀生長情況，若試驗孔出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌特征性的索狀結(jié)構(gòu)即取此部分培養(yǎng)物進行抗酸染色鑒定，若抗酸染色發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌則判定為MODS培養(yǎng)陽性，說明結(jié)核菌在有抗結(jié)核藥存在的情況下還能生長，視為有耐藥性，若接種40d后仍未觀察到結(jié)核分枝桿菌特征性的索狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)則判定為陰性［4］。此方法具有快速、敏感、檢測成本低的優(yōu)勢，不需要特殊儀器，操作安全，對預(yù)防耐藥結(jié)核菌的傳播、防止實驗室工作人員的感染具有重要意義，正在被國內(nèi)逐漸認識并應(yīng)用。但此法的缺點是觀察時間長了會導(dǎo)致觀察者視覺疲勞，

還有臨床常見的2種非結(jié)核分枝桿菌——恥垢分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌亦具有索狀生長特征，陸俊梅等［5］對MODS培養(yǎng)基進行了改良，在培養(yǎng)基中加入了對硝基苯磺酸，若對照孔有明顯索結(jié)構(gòu)細菌狀生長，硝基苯磺酸含藥孔有細菌生長，則說明標本中有非結(jié)核分枝桿菌，若對照孔內(nèi)有細菌生長，但無索狀結(jié)構(gòu)，判斷為污染。若對照孔有明顯索狀結(jié)構(gòu)細菌生長，加藥孔內(nèi)無索狀結(jié)構(gòu)生長則判定為該菌株對該藥物敏感，反之，則判定該菌株對該藥物耐藥。黃自坤等［4］對264例肺結(jié)核臨床疑似患者的痰標本和20例肺結(jié)核病患者的痰標本分別采用抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)基（L-J）培養(yǎng)法和MODS技術(shù)進行結(jié)核分枝桿菌的檢測。結(jié)果3種方法檢測20例非結(jié)核病患者痰標本結(jié)果均陰性；在264例肺結(jié)核臨床疑似患者的痰標本中，3種方法的陽性率分別為抗酸染色法28.8％、L-J培養(yǎng)法36.0％、MODS技術(shù)的陽性檢出率42.8％，其中在102例抗酸染色和（或）LJ培養(yǎng)陽性的痰標本中，MODS檢出97例（95.1％），在162例抗酸染色和L-J培養(yǎng)均為陰性的標本中，MODS陽性16例；若以臨床診斷為標準，3種方法敏感度和特異度分別為MODS 63.4％和97.8％、L-J培養(yǎng)法54.3％和100％、抗酸染色法43.3％和100％，MODS的陽性檢出中位時間為10d，明顯短于L-J培養(yǎng)的25d。認為MODS技術(shù)與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法相比，具有敏感度高、檢出時間短的優(yōu)勢，適用于結(jié)核病的臨床快速診斷。兒童結(jié)核往往癥狀不典型，痰標本留取困難，在抗酸染色陰性的患兒標本中，用MODS技術(shù)檢測胃抽吸物、鼻咽抽吸物和糞便標本同樣可以獲得快速、高效的檢測結(jié)果［6］。陳俊林等［7］應(yīng)用MODS技術(shù)分離到32株耐左氧氟沙星的耐藥結(jié)核分枝桿菌，再經(jīng)過基因測序，32株均有21位密碼子精氨酸-脯氨酸（CGA-CCA）突變和95位密碼子絲氨酸-蘇氨酸（AGC-ACC）突變，還有94位密碼子天冬氨酸-組氨酸（GAC-CAC）、天冬氨酸-甘氨酸（GAC-GGC）、天冬氨酸-丙氨酸（GAC-GCC）、絲氨酸-天冬酰胺（GAC-AAC）突變，90位密碼子天冬氨酸-甘氨酸（GAC-GGC）、GAC-TAC突變和91位密碼子TCGCCG突變。其中，MODS技術(shù)選擇出耐藥分枝桿菌，DNA測序鎖定突變位點。

3 BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)

BACTECMGIT 960是新一代產(chǎn)品，具有快速分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌和其他分枝桿菌的優(yōu)勢［8］，基本原理是在培養(yǎng)瓶的底部樹脂中包被有對培養(yǎng)基中的氧有高度敏感的熒光指示劑，此指示劑在有氧氣存在時被抑制，當結(jié)核分枝桿菌生長使氧氣消耗盡時，熒光顯示劑被激活而發(fā)出熒光，檢測儀測試熒光強度，并判定結(jié)果。儀器每小時自動檢測培養(yǎng)基內(nèi)細菌對氧消耗所致熒光強度的變化，將測到的熒光強度以生長單位形式報告標本生長情況［8］。此方法比較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法操作簡便，培養(yǎng)陽性率高于L-J法，缺點是無法觀察菌落，污染率略高于L-J法，產(chǎn)品依賴進口（美國BD公司產(chǎn)品），價格較貴。陳小蓉等［9］用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)和L-J法檢測了179例標本（178份痰，1份頸淋巴結(jié)穿刺物），BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)陽性標本培養(yǎng)時間9.5d，藥敏所需時間6.7d，L-J法為31.7d和28.0d（P＜0.01）。但2種方法的藥敏結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

4 噬菌體生物擴增（phage amp lified biologically assay，PhaB）法

分枝桿菌噬菌體是一種專門寄生于分枝桿菌的DNA病毒，具有嚴格的宿主特異性，并且只能感染活菌，分枝桿菌感染噬菌體后被裂解，釋放出子代噬菌體，子代噬菌體又可以感染隨后加入的指示細胞（恥垢分枝桿菌），如指示細胞被裂解，就會在瓊脂平板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑，沒有感染結(jié)核分枝桿菌的噬菌體則被其后加入的噬菌體殺滅劑滅活，已進入感染細菌的噬菌體不受影響，根據(jù)噬菌斑的有無和多少可以判斷是否為結(jié)核分枝桿菌［10］。從標本采集到判讀結(jié)果只需18～24h，此法敏感度高，如痰涂片抗酸染色需＞5 000條/mL結(jié)核菌才能查到陽性，而PhaB法＞100條/mL就能查到；特異度達99％以上，僅對結(jié)核分枝桿菌敏感，而對非結(jié)核分枝桿菌不敏感；此外，其檢測不需昂貴的儀器，試劑盒中含有全部檢測試劑，結(jié)果用肉眼即可判讀，特別適合涂片陰性、培養(yǎng)陽性的患者，被認為是開創(chuàng)了結(jié)核分枝桿菌微生物檢測的新紀元。馮爽等［11］將135例臨床確診為結(jié)核病的患者標本（痰、胸腔積液、肺泡灌洗液、腦脊液）和排除結(jié)核病患者的67例上述標本同時做了PhaB法、BACTEC MGIT培養(yǎng)法、涂片法，并對3種方法進行了比較，3種方法的檢出率分別為PhaB法48.2％（65/135），涂片法28.2％（38/135），BACTEC MGIT培養(yǎng)44.4％（60/135），PhaB法高于涂片法（P＜0.05）。此法可以檢測胸腔積液、腹腔積液、腦脊液、尿液、脊髓等多種標本；可用于結(jié)核病的試驗診斷、抗結(jié)核治療效果的評價、初診患者的鑒別診斷以及對人類免疫缺陷病毒感染高危人群的鑒別診斷。

5 聚合酶鏈式反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（polym erasechain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）

PCR-SSCP技術(shù)能檢測結(jié)核分枝桿菌分離株的多種耐藥遺傳標志，結(jié)核桿菌的耐異煙肼、利福平和乙胺丁醇主要與過氧化氫酶編碼的katG基因、aphC啟動子、inhA操縱子、kas A基因有關(guān)，乙胺丁醇耐藥與embA、B、C基因有關(guān)［12］，有的甚至katG基因缺失，正常情況下，利福平與RNA聚合酶B亞基（rpoB）特異性結(jié)合，阻斷RNA的合成而起到抑制細菌生長的作用?；蛲蛔兒髍poB亞基構(gòu)象會發(fā)生改變，從而降低與利福平的親和力。快速檢測出這些基因是否突變，對臨床判斷是否耐藥將具有重大意義。PCR-SSCP原理是根據(jù)單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當有一個堿基發(fā)生改變時，就會影響其空間構(gòu)象，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠電泳中受阻大小不同，因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以非常敏銳地將構(gòu)象有差異的分子分離開，PCR-SSCP比PCR更為簡便、快速、靈敏，近幾年被大量應(yīng)用。

6 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase china reation-restriction fragment length polymorphyism，PCR-RFLP）

PCR-RFLP也是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點上，使酶切位點增加或消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴增含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再在利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較確定是否變異。如耐乙胺丁醇菌株就存在多位點的突變（以306，328，406，497位4個密碼子多見），導(dǎo)致2個以上不同的氨基酸被置換而耐藥，embB基因（尤其是306位密碼子）突變是結(jié)核菌耐乙胺丁醇產(chǎn)生的主要原因［13-15］。賀紅艷等［16］對確診為結(jié)核的50株結(jié)核菌進行了PCRRFLP分析，結(jié)果只有5株為敏感株，45株異煙肼耐藥株，其中9株對異煙肼單耐藥，余45株為多耐藥，經(jīng)PCR-RFLP分析，5株敏感菌與H37Rv標準株輕質(zhì)凝膠電泳條帶一致，45株耐藥株中，有1株被消化成4個片段；又將在PCR-RFLP分析中的異常泳動帶的突變標本，進行DNA測序，其katG基因315位氨基酸密碼子第2位堿基發(fā)生點突變，由絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸，這就是基因的點突變。目前我國應(yīng)用此種方法的實驗室很多。

生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展促進了耐藥結(jié)核的實驗室診斷，有些是2項或幾項技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，如PCR聯(lián)合其他技術(shù)，耐藥性結(jié)核桿菌的檢出聯(lián)合基因測試，不僅找到了耐藥性菌株，也揭示了耐藥性產(chǎn)生的機制，為結(jié)核患者的早期治療提供了有利保證，但我國結(jié)核病防治工作仍然任重而道遠，需要長期不懈的努力，新的技術(shù)需要不斷開發(fā)，并應(yīng)用于臨床。

［1］初乃惠，黃學(xué)銳.喹諾酮類藥物在結(jié)核病治療中的應(yīng)用［J］.中華臨床醫(yī)師：電子版，2010，4（7）：905-907.

［2］全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告［J］.中國防癆雜志，2012，34（8）：485-580.

［3］汪謀岳，王娟.全國多耐藥結(jié)核病學(xué)術(shù)會議紀要［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，1997，20（6）：382-383.

［4］黃自坤，熊國亮，李俊明，等.顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術(shù)在結(jié)核病早期診斷中的應(yīng)用［J］.中華醫(yī)院感染雜志，2012，22（14）：3193-3196.

［5］陸俊梅，王潔，黃振辰，等.顯微鏡觀察藥物敏感檢測技術(shù)在痰標本直接藥敏試驗中的應(yīng)用［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（1）：21-25.

［6］黃自坤，李俊明.MODS技術(shù)的研究和應(yīng)用進展［J］.中國實驗診斷學(xué)，2012，16（3）：564-567.

［7］陳俊林，顧德林，施軍衛(wèi)，等.基因檢測及MODS技術(shù)快速診斷結(jié)核分枝桿菌對左氧氟沙星的敏感性研究［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（13）：1554-1555，1558.

［8］張濤，呂純芳，盧留珠，等.BACTEC MGIT 960系統(tǒng)快速培養(yǎng)分枝桿菌的效果評價［J］.臨床肺科雜志，2011，16（5）：717-718.

［9］陳小蓉，張俠，茅惠娟.BACTECMGIT 960系統(tǒng)與改良羅氏培養(yǎng)基抗酸分枝桿菌藥敏結(jié)果的評估［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，25（9）：1195-1196.

［10］胡嵐，王靜.噬菌體生物擴增法在快速檢測結(jié)核分枝桿菌中的研究現(xiàn)狀［J］.求醫(yī)問藥，2012，10（10）：458-459.

［11］馮爽，劉樹業(yè)，張立，等.噬菌體生物擴增法與常規(guī)方法在結(jié)核分枝桿菌檢測中的比較［J］.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，18（5）：920-922.

［12］張向東，張婷，牛建軍，等.探針熔解分析法快速檢測結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2011，27（1）：53-57.

［13］朱敏，李鋒，盛國平，等.應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)檢測痰中結(jié)核分枝桿菌katG、r poB、embB基因突變的研究［J］.中國防癆雜志，2007，29（6）：508-510.

［14］崔宜慶，杜中華，王靜，等.耐藥性結(jié)核分枝桿菌研究近況［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2010，10（22）：4376-4379，4382.

［15］張向暉，李奇鳳，楊堅，等.乙胺丁醇耐藥結(jié)核分枝桿菌embB基因分析［J］.石河子大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，25（6）：668-671.

［16］賀紅艷，薛欣，楚雍烈，等.結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥與kat G基因突變的相關(guān)性研究［J］.大家健康：中旬版，2011，27（2）：8-10.

（本文編輯：劉斯靜）

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1007-3205（2013）06-0742-03

2013-03-25；

2013-04-02

王明芹（1966-），女，河北平山人，武警河北總隊醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事結(jié)核病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.049