毛晶晶 綜述，李文春審校

（湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000）

臨床上由于醫(yī)源性膽管損傷、膽管結(jié)石、膽管腫瘤、膽管感染等原因?qū)е碌牡母瓮饽懝塥M窄以及一些先天性膽管疾病的治療，常用膽腸吻合內(nèi)引流術(shù)或外引流術(shù)等方法處理，由于這些手術(shù)需要把膽管切除或者切開(kāi)，再行各種方式的膽腸吻合，使得膽管、Oddis括約肌的結(jié)構(gòu)缺損或者功能損害，術(shù)后發(fā)生膽漏、膽管阻塞、膽管感染甚至膽汁性肝硬化等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)極大增高［1-3］。這使得尋找一種合適的能夠代替膽管和Oddi括約肌結(jié)構(gòu)和功能的人工膽管變得非常有必要，從而順利解決肝外膽管修復(fù)和重建的難題。隨著20世紀(jì)80年代以來(lái)組織工程學(xué)的發(fā)展，組織工程化膽管的應(yīng)用推動(dòng)了膽管替代治療的進(jìn)程［4］。組織工程的3個(gè)關(guān)鍵要素由支架材料、種子細(xì)胞以及細(xì)胞和材料的復(fù)合組成［5-7］，這使得組織工程化膽管中支架材料以及種子細(xì)胞的選擇至關(guān)重要，本文就組織工程中3個(gè)關(guān)鍵要素進(jìn)行綜述。

1 支架材料

目前組織工程化膽管中的支架材料大致有人工合成和生物源性兩種［8］。人工合成的支架材料目前用于臨床的有高分子多聚物材料、合金類(lèi)材料。研究者們就這些材料開(kāi)展了廣泛的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.1 人工合成的不可降解吸收型的高分子材料支架 不可降解吸收型的高分子材料支架如聚四氟乙烯（PTFE）、聚羥基乙酸（PGA）、聚L-乳酸（PLLA）、乳酸和乙醇酸共聚物（PLGA）等。這些材料部分已用于臨床。Zografakis等［9］采用鐵氟龍（商品名，為PTFE）制成的材料植入動(dòng)物狗體內(nèi)，剖腹探查發(fā)現(xiàn)所有動(dòng)物血清的堿性磷酸酶（ALP）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）均有升高，在材料植入膽管內(nèi)時(shí)表現(xiàn)出的生物相容性微乎其微，但是在膽管和周?chē)慕M織中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。作為在體內(nèi)不可降解性材料，氟橡膠246B、PTFE、聚氨酯熱塑性彈性體TPE-80B，它們?cè)隗w內(nèi)長(zhǎng)期留存是否對(duì)膽管細(xì)胞的生長(zhǎng)分化產(chǎn)生影響，是否會(huì)釋放有毒物質(zhì)，遠(yuǎn)期療效有待觀察。

1.2 人工合成的可降解的多聚物材料 人工合成的可降解的多聚物材料也成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。Aikawa等［10］用可降解的聚合物（BAP）作為膽管缺損的替代物，將豬的正常膽管壁呈梭形的部分被切開(kāi)，再將BAP補(bǔ)片植入切開(kāi)位點(diǎn)，剖腹探查植入位點(diǎn)的修復(fù)情況，以及觀察BAP是否發(fā)生了變形；在補(bǔ)片植入和后續(xù)剖腹手術(shù)時(shí)均從動(dòng)物體內(nèi)取血進(jìn)行生化分析；結(jié)果顯示所有植入了BAP的實(shí)驗(yàn)用豬均存活至宰殺，而且體質(zhì)量都有增加，也無(wú)黃疸跡象；進(jìn)行了BAP修補(bǔ)的豬膽管未出現(xiàn)梗阻，血生化分析也提示沒(méi)有肝膽酶活動(dòng)的增加；組織學(xué)觀察，顯示在新生膽管內(nèi)出現(xiàn)了腺體結(jié)構(gòu)；BAP和豬自體膽管幾乎融為一體不能辨別，體內(nèi)膽管造影術(shù)顯示植入位點(diǎn)的膽管擴(kuò)張，肝內(nèi)膽管卻沒(méi)有，血生化分析顯示在正常水平之內(nèi)，組織學(xué)觀察證實(shí)在植入補(bǔ)片的位置有類(lèi)似自體膽管的立體圓柱形上皮細(xì)胞生長(zhǎng)；由此提出此替代物有作為新型膽管損傷治療的潛在前景。

1.3 合金類(lèi)支架 合金類(lèi)的支架目前也有部分應(yīng)用于臨床，但是植入后引起較大的排斥反應(yīng)，長(zhǎng)期置于體內(nèi)不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，而且硬度高，缺乏韌性，不利于手術(shù)縫合，易脫落，制造成本高，應(yīng)用受限。

1.4 可降解的生物源性支架 隨著組織工程學(xué)研究的進(jìn)一步深入，可降解的生物源性的支架逐漸被研究者們運(yùn)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探查。這類(lèi)材料有的取材于人體其他部位組織，但是需要再次手術(shù)取材，增加了患者的疼痛和創(chuàng)傷，目前研究多集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的探討。Capitanich等［11］將大白鼠膽管切除3mm，再用自體靜脈進(jìn)行修補(bǔ)，在術(shù)后1、2、3個(gè)月時(shí)對(duì)各組大白鼠行膽管造影術(shù)，再次剖腹手術(shù)以及血液測(cè)試，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)膽汁淤滯，移植替代物表面有類(lèi)似膽管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，但尚需更多實(shí)驗(yàn)以及臨床研究才能支持自體靜脈可以作為膽管缺損修補(bǔ)的替代物這一結(jié)論。也有的取材于動(dòng)物組織，如豬的小腸黏膜下層，這類(lèi)去除細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)具有豐富的膠原蛋白和彈性蛋白，沒(méi)有免疫源性，和機(jī)體無(wú)排斥反應(yīng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈三維性，富含孔洞，有利于細(xì)胞深入內(nèi)層生長(zhǎng)，國(guó)外Rosen等學(xué)者將豬的小腸黏膜下層植入狗體內(nèi)，作為膽管修復(fù)的材料，結(jié)果證明，這類(lèi)材料不僅可在狗體內(nèi)降解，還能使新生成的細(xì)胞和組織成分具有植入時(shí)的形態(tài)，產(chǎn)生的炎性因子也很少［12］。Miyazawa等［13］報(bào)道可吸收的生物源性的管狀支架在作為膽管旁路植入肝外膽管時(shí)，使膽管細(xì)胞在接入位點(diǎn)開(kāi)始再生修復(fù)，并且一直延續(xù)到這個(gè)人工膽管降解和吸收，這種人工膽管的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)促進(jìn)膽管疾病治療的研究發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，可降解型的生物源性的支架植入體內(nèi)后，不僅可以緩慢分解，降解后產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無(wú)害，最后還可以被組織吸收；同時(shí)對(duì)自體組織不會(huì)產(chǎn)生刺激，不會(huì)損傷膽管內(nèi)壁的黏膜和細(xì)胞，還可以使組織生長(zhǎng)維持植入時(shí)的形態(tài)，利于膽管上皮細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)，能夠?qū)⒛懼^好地引流，減少膽汁淤滯，這使得其具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。從長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，可降解性的生物源性的支架相比人工合成的高分子材料和合金類(lèi)的支架具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

2 種子細(xì)胞

種子細(xì)胞一般來(lái)源于在體外具有多向分化能力的各種干細(xì)胞，易于分離獲取，具有無(wú)限自我復(fù)制及增殖功能，它們貼附在支架材料表面以及內(nèi)層結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)，能發(fā)揮組織工程血管、瓣膜或膽管等所要替代的正常組織的生理功能。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）擁有很強(qiáng)的向各種來(lái)自三胚層的細(xì)胞分化的能力，它在體外還能高度擴(kuò)增，使得細(xì)胞移植和組織工程領(lǐng)域的學(xué)者們對(duì)其逐漸關(guān)注［14］。最近研究表明，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能極大地促進(jìn)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞生長(zhǎng)，還具有向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的潛能，同時(shí)，這些細(xì)胞不會(huì)引起移植排斥反應(yīng)，不會(huì)產(chǎn)生免疫抑制的不良反應(yīng)［15］。Lin等［16］將BMSCs誘導(dǎo)分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，并分別對(duì)其進(jìn)行鑒定，后進(jìn)一步的措施是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，把分化提純的膽管細(xì)胞通過(guò)內(nèi)窺鏡注射入膽漏的部位，檢測(cè)動(dòng)物血中的膽紅素，并用超聲掃描動(dòng)物腹部，觀察植入的膽管細(xì)胞是否可以治療膽漏，然而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有待證實(shí)。徐勇等［17］在體外分離培養(yǎng)大鼠的MSCs，并用細(xì)胞生長(zhǎng)因子將其誘導(dǎo)分化為膽管的平滑肌細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，和羥基PLGA復(fù)合培養(yǎng)，顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好，還能分泌細(xì)胞外基質(zhì)。這些研究均提示BMSCs具有作為組織工程化膽管種子細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值，但由于組織工程化膽管研究目前也屬于新興的研究課題，對(duì)種子細(xì)胞的關(guān)注較少，關(guān)于種子細(xì)胞的選擇仍有待考察。

3 支架和種子細(xì)胞的復(fù)合培養(yǎng)

支架和種子細(xì)胞的相容性也是組織工程技術(shù)研究的一大課題。成功的組織工程化膽管應(yīng)是種子細(xì)胞能在膽管支架上貼附和深入生長(zhǎng)，并能發(fā)揮所替代的細(xì)胞的功能，和機(jī)體良好相容，不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，膽汁流動(dòng)通暢，不發(fā)生堵塞，也無(wú)膽漏，能長(zhǎng)期留存于機(jī)體，無(wú)不良反應(yīng)［18-20］。

組織工程器官的構(gòu)建，即細(xì)胞與支架材料的復(fù)合是組織工程的關(guān)鍵［21］。將種子細(xì)胞種植在具有特定幾何形狀的支架材料上，使種子細(xì)胞黏附、鋪展、生長(zhǎng)、分化成具有特定功能的、幾何形狀與細(xì)胞支架相似的組織和器官。常用的構(gòu)建組織工程化膽管的有兩種方法：體外構(gòu)建和體內(nèi)構(gòu)建。體外構(gòu)建是在體外將種子細(xì)胞種植在膽管支架之上，復(fù)合培養(yǎng)至種子細(xì)胞分化成熟具有功能后，再移入機(jī)體內(nèi)。體內(nèi)構(gòu)建是將支架材料先放入機(jī)體內(nèi)，待自體細(xì)胞貼附其上生長(zhǎng)。目前多用的是第2種方式。體外構(gòu)建組織工程化膽管難度較高，支架材料和種子細(xì)胞的要求高，且膽管處于流體環(huán)境之中。種子細(xì)胞在體外與支架復(fù)合后具有良好的活力，但它們均是將細(xì)胞與支架材料在靜止?fàn)顟B(tài)、無(wú)特殊壓力和環(huán)境變化的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)，即靜態(tài)培養(yǎng)，缺點(diǎn)是不具備膽汁流、膽管壓力等實(shí)際生理環(huán)境，制成的組織工程化膽管結(jié)構(gòu)紊亂、力學(xué)強(qiáng)度低、抗感染能力差，臨床使用可行性差。種子細(xì)胞與支架材料的復(fù)合的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模式將是構(gòu)建組織工程器官的發(fā)展趨勢(shì)［22］。動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可提供符合生理?xiàng)l件的培養(yǎng)環(huán)境，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞定向排列，細(xì)胞外基質(zhì)分泌和膠原重構(gòu)，使組織工程化膽管具有生物活性、其結(jié)構(gòu)和功能與自體膽管相類(lèi)似的人工膽管，增強(qiáng)臨床應(yīng)用的可行性。

4 結(jié) 語(yǔ)

組織工程化膽管作為一門(mén)新的研究課題，人們對(duì)其研究多限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床應(yīng)用開(kāi)展少。但近年來(lái)對(duì)膽管支架材料的選擇及制備進(jìn)行了廣泛的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，取得了一些進(jìn)展，還有學(xué)者已開(kāi)始利用大動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)，但是仍處于起步階段，隨著人們對(duì)各種支架材料的來(lái)源的探討，對(duì)種子細(xì)胞的選擇，關(guān)于組織工程化膽管的認(rèn)識(shí)逐漸深入，相信在將來(lái)能制成具有真正臨床應(yīng)用價(jià)值的組織工程化膽管，為廣大肝膽疾病患者帶來(lái)福音。

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