張 霞，高維娟

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

綜述講座

Caspase-3與腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究進(jìn)展*

張 霞1，高維娟2△

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

半胱氨酸蛋白酶-3;腦缺血再灌注;細(xì)胞凋亡

缺血性腦血管病是目前神經(jīng)內(nèi)科最常見的一種疾病，其致殘率非常高。治療一般是以疏通堵塞的血管、改善病變部位的血液供應(yīng)為主，但當(dāng)缺血部位的血液供應(yīng)好轉(zhuǎn)以后就容易發(fā)生更加嚴(yán)重的再灌注損傷[1]。腦缺血再灌注損傷是腦缺血后腦組織恢復(fù)血流灌注時(shí)引起腦細(xì)胞更嚴(yán)重?fù)p傷的一種病理生理現(xiàn)象。研究表明，腦組織缺血早期，缺血區(qū)以神經(jīng)細(xì)胞壞死為主，而后期缺血半暗帶發(fā)生的遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡則以細(xì)胞凋亡為主[2]。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是個(gè)不同于細(xì)胞壞死的新概念，并使人們對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有了一個(gè)全新的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外各種因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程，是一個(gè)在基因調(diào)控下的嚴(yán)密、完整的程序化過程，以細(xì)胞核濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段、細(xì)胞縮小、最終形成凋亡小體(apoptosis body)等形態(tài)變化為特征[3]。細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及調(diào)控過程十分復(fù)雜，涉及一系列相關(guān)分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前尚處于揭示階段?，F(xiàn)就Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑在腦缺血再灌注損傷中的作用做一綜述。

1 Caspase-3酶原及活酶的結(jié)構(gòu)

Caspase家族是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，是目前已知的凋亡最后執(zhí)行因子。凋亡的最后實(shí)施是通過Caspases的激活而實(shí)現(xiàn)的，而Caspase-3為該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游關(guān)鍵因子，在各種啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐的作用[4]。

Caspase-3又稱為半胱氨酸蛋白酶32(cysteine protease P32,CPP32)，或稱Yama、apopain等，是1994年被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)促凋亡調(diào)節(jié)基因，相對(duì)分子質(zhì)量為32kD[5]，在人類基因中定位于4q32-4q35.1處，其由3個(gè)區(qū)域構(gòu)成:氨基端的原域(prodomain)、大亞單位和小亞單位。正常情況下，Caspase-3在細(xì)胞質(zhì)中以無活性的酶原形式存在，其激活過程是一個(gè)產(chǎn)生p20/p10二聚體的蛋白水解事件。Caspase-3酶原在活化過程中從p28-Ser29和Asp175-Ser176二處被剪切，并形成P20和P12兩個(gè)片段，兩種亞基借P12再連接成具有活性的Caspase-3異二聚體?；罨腃aspase-3的三維結(jié)構(gòu)為兩個(gè)異二聚體(大亞單位和小亞單位)以相對(duì)的方式形成一個(gè)四聚體，兩個(gè)小亞單位在中間，大亞單位在外周。每個(gè)異二聚體包含一個(gè)活性位點(diǎn)，由大小亞單位的氮基酸殘基共同組成，它們對(duì)結(jié)合和催化底物來說都是必需的[6]。兩個(gè)亞單位組成的異二聚體，是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，可以導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體。

2 Caspase-3酶原的激活

Caspase-3酶原能被Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12及顆粒酶B等所激活。最近的研究表明，缺血-再灌流后細(xì)胞內(nèi)大量自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，同時(shí)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器也損傷，進(jìn)而能從不同的途徑激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，Caspases-3激活途徑主要有三條[7]:線粒體/細(xì)胞色素C通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。腦缺血再灌注后，可以通過其中的一個(gè)或多個(gè)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)，進(jìn)而激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.1 線粒體途徑活化Caspase-3 細(xì)胞凋亡的線粒體通路:當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)ATP耗竭，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，自由基增多，受體介導(dǎo)的死亡信號(hào)激活(Fas和TNF-R)及促凋亡和抗凋亡的Bc1-2家族蛋白的表達(dá)發(fā)生變化時(shí)，均可引起線粒體膜孔開放，導(dǎo)致線粒體通透性改變。線粒體通透性改變的結(jié)果是線粒體腫脹，內(nèi)膜極化，氧化磷酸化脫耦連，以及內(nèi)膜蛋白(細(xì)胞色素-c，凋亡誘導(dǎo)因子AIF)釋放。AIF可活化效應(yīng)性凋亡蛋白酶，進(jìn)而激活線粒體釋放細(xì)胞色素-c(Cyt-C)大量進(jìn)入胞漿，在dATP/ATP存在的條件下，與凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)結(jié)合，形成cyt-c-Apaf-1復(fù)合物，此復(fù)合體通過Apaf-1氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白相互作用，以1:1比例募集胞質(zhì)中的Caspase-9，Caspase-9酶原之間因相互靠近，自我剪切而活化[8]。活化的Caspase-9進(jìn)而激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2.2 細(xì)胞膜途徑激活Caspase-3 細(xì)胞凋亡的死亡受體通路:死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族成員，可傳導(dǎo)由特定的死亡配體引起的凋亡信號(hào)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，至少有5種死亡受體在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中起作用，最典型的是Fas。一旦細(xì)胞受到某些凋亡信號(hào)的刺激， Fas分子可與其特異性配體Fas-L結(jié)合。Fas-L以同源三聚體復(fù)合物形式存在, 每一個(gè)Fas-L三聚體可結(jié)合三個(gè)Fas分子，導(dǎo)致三個(gè)Fas分子內(nèi)的DD(Death domain)相互串聯(lián)。串聯(lián)的Fas的DD可以與FADD(Fasassociated death domain)的DD結(jié)合，這種結(jié)合又導(dǎo)致FADD的DED(Death effectdomain)與Caspase-8酶原的DED類似區(qū)域結(jié)合，從而激活Caspase-8，Caspase-8進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá) 細(xì)胞缺血缺氧、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、ATP耗竭、大量自由基的產(chǎn)生、鈣超載、蛋白降解減弱等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)功能障礙，從而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。過度ERS通過PERK(PERK為I型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，屬于elf2a蛋白激酶家族成員)活化、elf2a磷酸化等途徑誘導(dǎo)Caspase-12、CHOP(C/EBP homology protein是 一個(gè)b-zip轉(zhuǎn)錄因子，屬于CCAATP增強(qiáng)子相連蛋白的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族，又稱作GADDl53)等活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CHOP通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)，耗竭谷胱甘肽，促進(jìn)反應(yīng)性氧族產(chǎn)生等，進(jìn)而活化Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]?；钚訡aspase-12需則與另外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子協(xié)同使Caspase-9激活，活化的Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效應(yīng)Caspase，效應(yīng)Caspase切割多ADP-聚合酶(PARP)和多種其它細(xì)胞內(nèi)的底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，屬于非Cyt-c依賴的特異級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。

3 Caspase-3與腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡

3.1 Caspase-3可促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡腦缺血/再灌注損傷是一種常見的、復(fù)雜的病理生理過程[12]。Tominaga等[13]首次證實(shí)缺血性腦損傷可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。近年來，許多學(xué)者也從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方面研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡參與了腦缺血再灌注損傷。有研究表明[14]，腦缺血后隨著再灌注時(shí)間的延長，缺血側(cè)皮層凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，主要分布在梗死灶邊緣區(qū)，48h凋亡細(xì)胞達(dá)到高峰，說明凋亡在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用。Caspase-3也參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程，并在腦缺血再灌注損傷中起重要的作用[15]。近來還認(rèn)為Caspase-3的激活是參與腦缺血后神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵步驟, Caspase-3是最終執(zhí)行者[16],在腦缺血損傷中起重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[17]顯示,在成年正常大鼠腦組織中,Caspase-3表達(dá)水平較低。腦缺血后,缺血半暗帶區(qū)的Caspase-3表達(dá)明顯增加，并在24h達(dá)到高峰[18]。趙敏等研究證實(shí)[19]，大鼠局灶性腦缺血及再灌注早期，Caspase-3表達(dá)變化不明顯，再灌注6h-48h逐漸增高，在48h達(dá)到高峰，與神經(jīng)元凋亡DNA裂解率表達(dá)時(shí)間分布一致，幾乎是在相同的時(shí)間，同樣提示Caspase-3參與了缺血后細(xì)胞凋亡過程。應(yīng)用Caspase-3抑制劑可使缺血神經(jīng)元的損傷明顯減輕，也支持腦細(xì)胞缺血死亡涉及Caspase-3的觀點(diǎn)[20]。Le研究也表明，和正常大鼠相比，Caspase-3基因敲除的大鼠腦缺血2h再灌注48h后，皮層的梗死體積降低了55%，TUNEL陽性細(xì)胞密度下降了36%，說明Caspase-3在腦缺血再灌注細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要作用[21]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在缺血缺氧性腦損傷及腦缺血再灌注損傷中，應(yīng)用Caspase-3抑制劑可有效地減少腦缺血后神經(jīng)元凋亡的數(shù)量，從而起到腦保護(hù)作用[22]。以上的研究結(jié)果說明，Caspase-3參與了缺血性腦損傷，并在缺血神經(jīng)元的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

3.2 Caspase-3在腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制 Namura[23]在小鼠MCAO模型中觀察到再灌流后不僅Caspase-3mRNA表達(dá)增加，而且Caspase-3裂解物免疫反應(yīng)也增強(qiáng)?；罨蟮腃aspase-3可以切割許多蛋白質(zhì)底物, 所作用的底物多為維持細(xì)胞生命活動(dòng)的重要功能蛋白，它們分別參與細(xì)胞骨架重建、DNA修復(fù)和mRNA裂解。多種多樣的刺激因素均可以激活Caspase-3，引起多效基因變化，使胞質(zhì)、胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)降解失活[24,25],從而導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性地走向凋亡。

目前所發(fā)現(xiàn)的Caspases的底物一共有40種，其中大都可為Caspase-3所降解。Caspase-3可以水解結(jié)構(gòu)蛋白(A-spectrin、B-spectrin、tau蛋白等)、看家蛋白(actin、fodrin、keratin)等，使細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，核蛋白瓦解，染色體濃縮。Caspase-3也可以水解脫氧核糖核酸酶(CAD)的抑制蛋白ICAD，使CAD 活化進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮核酸酶功能，使 DNA斷裂進(jìn)而降解染色體，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3還可以裂解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去活性，發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用。同時(shí)，Cheng等[26]研究證實(shí)，當(dāng)Bcl-2蛋白被Caspase-3直接剪切，剪切后形成的片段可以進(jìn)一步促進(jìn)下游Caspase-3激活和放大Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這樣就形成了一個(gè)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正反饋環(huán)路，證明了其裂解產(chǎn)物也可以促進(jìn)凋亡。Caspase-3 還能水解并滅活DNAPKcs、PARPD 等DNA 修復(fù)酶，阻斷DNA的復(fù)制與修復(fù)，干擾剪切，破壞DNA結(jié) 構(gòu)。Caspase-3還 能 識(shí) 別PARP(poly ADP-ribose polymerase)中 的Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)序列，從而切割PARP，被切割的PARP激活受PARP負(fù)調(diào)控的核酸內(nèi)切酶的活性，最終使核小體間的DNA 降解，出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上的DNA梯帶。Nicholson等[27]報(bào)道，活性Caspase-3能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中剪切多聚ADP-核糖多聚酶導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Endres等[28]同樣證實(shí)了活性Caspase-3的這一重要效應(yīng)。有研究報(bào)道,Caspase-3還能誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)吞噬信號(hào)，使細(xì)胞水解為凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬消除，產(chǎn)生凋亡的不可逆效應(yīng)。

4 結(jié)語

腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，諸多研究顯示其發(fā)生是多因素協(xié)同作用的結(jié)果，可通過各種途徑激活Caspase-3，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。了解Caspase-3在不同條件下的表達(dá)情況，可選擇合適的時(shí)間窗有針對(duì)性地選用Caspase-3抑制劑，盡量減少腦缺血再灌注后神經(jīng)元的凋亡，對(duì)于阻止腦神經(jīng)功能的進(jìn)一步惡化、改善腦神經(jīng)功能具有重要意義。

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Q255

A

1004-6879(2013)01-0055-04

2012-10-11)

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072923)

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