王 鳴 綜述，王志強(qiáng)審校

（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院南樓消化內(nèi)鏡診療科，北京100853）

蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略能高通量地、動(dòng)態(tài)地對(duì)比分析健康和疾病不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，可有效地應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、鑒定、腫瘤分類、治療效果的評(píng)價(jià)及腫瘤發(fā)生機(jī)制等方面的研究，使得腫瘤的診斷、分類、療效評(píng)價(jià)由過去應(yīng)用單一的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行判斷發(fā)展成為現(xiàn)在的應(yīng)用蛋白質(zhì)譜或基因表達(dá)譜的改變來進(jìn)行綜合判斷。

蛋白組學(xué)研究技術(shù)中雙向凝膠電泳技術(shù)是目前使用較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。雙向凝膠電泳技術(shù)及其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)無法進(jìn)行多組樣本的同時(shí)研究，也無法進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即便是此后出現(xiàn)的同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)也只能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量研究。2004年美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出了一項(xiàng)新的同位素標(biāo)記技術(shù)：同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，ITRAQ），可真正實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的絕對(duì)定量檢測(cè)，其關(guān)鍵是iTRAQ試劑。該試劑由三部分組成，一端為指示基團(tuán)，中間為中性平衡基團(tuán)，另一端為反應(yīng)基團(tuán)，指示基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量有4種，分別為114.1×103、115.1×103、116.1×103和117.1×103，與之相對(duì)應(yīng)的平衡基團(tuán)相對(duì)分子質(zhì)量依次為31×103、30×103、29×103和28×103，4種指示基團(tuán)及其相對(duì)應(yīng)的平衡基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量和都為145.1×103，故iTRAQ技術(shù)有4個(gè)試劑，即114、115、116、117，可以同時(shí)研究4組樣品；而反應(yīng)基團(tuán)能與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記同重元素，亦也可以標(biāo)記修飾后的氨基酸，故可對(duì)磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾蛋白進(jìn)行定量、定性研究。ITRAQ聯(lián)合液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（liquid chromatography coupled mass spectrum）可同時(shí)檢測(cè)4組或者8組的樣品，為多個(gè)不同時(shí)間段的樣品分析、膜蛋白研究、疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與鑒定提供定量信息，并可為感興趣的目標(biāo)蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量，且比其他蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法更加得敏感［1－3］。iTRAQ技術(shù)的大體流程為：樣品先經(jīng)胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解成肽段，隨后用iTRAQ試劑多重標(biāo)簽進(jìn)行差異標(biāo)記，再將標(biāo)記樣本相混合，最后用LC－MS／MS進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)后得到的數(shù)據(jù)采用生物信息學(xué)進(jìn)行分析［2］。

本文綜述了iTRAQ技術(shù)在消化系腫瘤研究中的應(yīng)用，主要從標(biāo)志物篩查、腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及腫瘤治療研究三方面進(jìn)行闡述。

1 標(biāo)志物篩查研究

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)早先是主要被應(yīng)用于尋找腫瘤標(biāo)志物，科學(xué)家們期待能夠通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究尋找到能夠應(yīng)用于腫瘤診斷、甚至早期診斷的標(biāo)志物。iTRAQ技術(shù)自應(yīng)用來，也是如此。

Pawar等［4］采用了iTRAQ結(jié)合液相質(zhì)譜技術(shù)比較了食管癌及癌旁組織的蛋白差異，共發(fā)現(xiàn)257個(gè)蛋白在兩組間存在差異，其中包含一些既往已被證實(shí)在食管癌組織中升高的蛋白質(zhì)，如凝血酶敏感蛋白1、骨膜蛋白1及熱休克蛋白70等，此外還發(fā)現(xiàn)并通過免疫組化證實(shí)一些新的蛋白在食管癌組織中高表達(dá)，如前列腺血清酸性磷酸酶、網(wǎng)格蛋白1、二硫鍵異構(gòu)酶A4；證實(shí)iTRAQ技術(shù)用于尋找腫瘤標(biāo)志物可靠，且能有新的發(fā)現(xiàn)。

Loei等［5］通過對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS and MKN7分泌物蛋白組學(xué)檢測(cè)，并從中篩選出胃癌細(xì)胞分泌蛋白，并對(duì)蛋白進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)顆粒體蛋白（GRN）在胃癌組織中顯著升高，且在血清中得到進(jìn)一步驗(yàn)證；用血清血清顆粒體蛋白診斷胃癌ROC曲線下面積可達(dá)0.64，認(rèn)為這一指標(biāo)可以用于胃癌診斷。Chong等［6］比較健康人、早期胃癌、晚期胃癌患者血清蛋白差異，發(fā)現(xiàn)血漿C9蛋白在胃癌患者中顯著升高，且在晚期胃癌中升高高于早期胃癌，盲法檢測(cè)顯示C9用于診斷胃癌的靈敏度可達(dá)90%，特異度可達(dá)74%，血漿C9檢測(cè)有望能夠改善胃癌的篩查。而Chong等［7］同時(shí)也通過胃癌動(dòng)物模型和細(xì)胞系研究，發(fā)現(xiàn)α胰蛋白酶抑制劑H3重鏈在胃癌動(dòng)物模型血清中顯著升高，隨后在胃癌患者及對(duì)照血清中的檢測(cè)證實(shí)，血清α胰蛋白酶抑制劑H3重鏈可用于胃癌診斷，用于診斷胃癌的靈敏度可達(dá)96%、特異度可達(dá)66%。

在肝癌標(biāo)志物研究中，許多研究者都用iTRAQ技術(shù)通過不同的標(biāo)本路徑入手，得到了很多新的發(fā)現(xiàn)。Chaerkady等［8］從肝癌組織標(biāo)本入手，找到了一些新的蛋白如干擾素誘導(dǎo)蛋白、蛋白乳表皮生長(zhǎng)因子8、骨髓相關(guān)分化標(biāo)志物、纖維介素等在肝癌組織中高表達(dá)，而幾乎所有涉及尿素代謝途徑的蛋白都顯著降低，證實(shí)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于尋找腫瘤標(biāo)志物是可行的，且有新的發(fā)現(xiàn)。Lee等［9］則選擇血清樣本研究，以和肝癌的起源、進(jìn)展相關(guān)N－聯(lián)聚糖蛋白為篩尋目標(biāo)，采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)肝癌和健康人血漿蛋白，找到了14個(gè)差異的N－聯(lián)聚糖蛋白，其中玻連蛋白及抗凝血酶Ⅲ在肝癌患者血清中升高，在肝癌組織中也發(fā)現(xiàn)同步升高。除肝癌標(biāo)志物外，Wang等［10］通過對(duì)動(dòng)物肝癌轉(zhuǎn)移腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)醛醇酶在肝癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型組織和血清中升高，并在人肝癌患者血清中得以證實(shí)，轉(zhuǎn)醛醇酶用于診斷轉(zhuǎn)移肝癌和非轉(zhuǎn)移肝癌其靈敏度為77.8%，特異度為86.1%。

Jankova等［11］用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜比較了結(jié)腸癌腫瘤黏膜及癌旁正常黏膜的蛋白差異，其中涉及糖酵解、鈣結(jié)合及蛋白酶抑制等方面蛋白在結(jié)腸癌組織中升高，而這些蛋白可能成為結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物。為了研究更加精確，得到純度更加高的腫瘤標(biāo)本，通過顯微切割結(jié)腸癌組織獲取結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)iTRAQ檢測(cè)鑒定發(fā)現(xiàn)嗅球蛋白4在腺瘤及早期結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，Besson等［12］認(rèn)為嗅球蛋白4可能作為早期的結(jié)腸癌標(biāo)志物。以上研究結(jié)果均在組織中得以證實(shí)，但未在血清中得以驗(yàn)證，其結(jié)果作為診斷的標(biāo)志物效果則有待商榷。而Fan等［13］采用iTRAQ技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌及癌旁組織，發(fā)現(xiàn)SEC61β表達(dá)于癌組織中3倍高于癌旁正常組織，研究發(fā)現(xiàn)SEC61β用于診斷結(jié)腸癌的靈敏度可達(dá)79%，特異度可達(dá)75%，這一結(jié)果將來可能改善結(jié)腸癌的臨床診斷。

2 腫瘤機(jī)制研究

腫瘤生長(zhǎng)受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中就受到腫瘤細(xì)胞的分泌蛋白調(diào)節(jié)。iTRAQ蛋白技術(shù)被用于研究胃癌不同分化能力的細(xì)胞系分泌蛋白。研究發(fā)現(xiàn)并已驗(yàn)證組織蛋白酶S在胃癌細(xì)胞分泌物中高表達(dá)。組織蛋白酶S涉及胃癌細(xì)胞分化遷移侵襲，大約197種蛋白和組織蛋白酶S途徑相關(guān)。組織蛋白酶S與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而這一結(jié)果將為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)［14］。為研究結(jié)腸癌中Smad4調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β傳導(dǎo)（TGF－β）途徑，Ali等［15］運(yùn)用iTRAQ 技術(shù)比較Smad4陰性和Smad4陽性的結(jié)腸癌細(xì)胞系蛋白差異，發(fā)現(xiàn)TGF－β途徑中S100A4蛋白的表達(dá)與Smad4相關(guān)。Ghosh等［16］通過比較結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞系和原位細(xì)胞系的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中β－連環(huán)蛋白低表達(dá)伴隨鈣結(jié)合蛋白（一種β－連環(huán)蛋白降解蛋白）高表達(dá)；提示鈣結(jié)合蛋白高表達(dá)和腫瘤的高轉(zhuǎn)移相關(guān)，且鈣結(jié)合蛋白高表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞黏附功能降低，這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)將有助于人們更好的理解結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。類似iTRAQ技術(shù)應(yīng)用于消化系腫瘤機(jī)制的研究不多，但隨著研究深入，這類研究會(huì)給人們?cè)絹碓蕉嗟捏@喜。

3 腫瘤治療探索

肝癌多重耐藥性一直是肝癌治療的障礙，其耐藥的原因錯(cuò)綜復(fù)雜。iTRAQ技術(shù)比較BEL7402肝癌細(xì)胞系5－FU耐藥和非耐藥細(xì)胞株的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞株中ANXA3蛋白高度表達(dá)，有助于進(jìn)一步理解肝癌耐藥原因，為肝癌藥物治療提供新思路［17］。

短鏈脂肪酸被證實(shí)能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞成熟，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，分化及凋亡。Tan等［18］通過比較經(jīng)丁酸鹽短期干預(yù)后的結(jié)腸癌細(xì)胞及未干預(yù)的結(jié)腸癌細(xì)胞蛋白差異，發(fā)現(xiàn)一批與丁酸鹽作用相關(guān)蛋白，這些蛋白涉及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和轉(zhuǎn)移方面，明確丁酸鹽治療結(jié)腸癌的機(jī)制，也提供了結(jié)腸癌化療和新藥物治療的新靶點(diǎn)。而Kilner等［19］則通過iTRAQ技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)短鏈脂肪酸中除丁酸鹽外戊酸鹽、丙酸鹽均有相類似作用，但具體作用方式略有不同。丁酸鹽作用靶點(diǎn)主要在于角蛋白和中間絲，而戊酸鹽位點(diǎn)在β微管蛋白亞型表達(dá)和微管，丙酸鹽則涉及中間絲，這些研究結(jié)果為治療提供了更加明確的方向。抗腫瘤藥物L(fēng)Y294002抑制結(jié)腸癌磷酸肌醇3激酶途徑，但其具體機(jī)制一直不明。通過比較結(jié)腸癌細(xì)胞系經(jīng)LY294002處理前后蛋白差異，研究者發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞LY294002處理后氨?；璽RNA合成酶、分子伴侶及糖酵解酶等顯著減少，而這些酶與P53基因相關(guān)，故LY294002抗血管生成作用可能通過P53基因作用，故抑制P53基因突變?cè)诮Y(jié)腸癌磷酸肌醇3激酶途徑治療中起重要作用［20］。

iTRAQ技術(shù)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，但其也存在著一定的缺點(diǎn)性，如：由于iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中的所有蛋白結(jié)合，易受樣本中雜質(zhì)蛋白及樣本處理過程中緩沖液污染；因此對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行預(yù)處理，并盡量減少操作過程中的污染，操作的精細(xì)和質(zhì)量控制尤為重要，另外，iTRAQ試劑昂貴；但無論如何iTRAQ技術(shù)大大促進(jìn)了消化系腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究，隨著后續(xù)技術(shù)的完善和研究投入增加，iTRAQ必將更加廣泛地應(yīng)用在消化系腫瘤的各個(gè)方面，且研究將會(huì)更加的精細(xì)和完善。

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