閆秋麗,化 維,余良主

(1.北京市昌平區(qū)華一醫(yī)院,北京 102208;2.湖北科技學(xué)院,咸寧 437100)

在壓力負(fù)荷和神經(jīng)體液刺激作用下,心肌細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性肥大生長,以暫時性改善心臟功能。但這種心臟適應(yīng)性肥厚能夠使心血管發(fā)病率和死亡率增高,這主要與其引起的電生理重塑和心律失常有關(guān)[1]。心臟的電生理重塑通常表現(xiàn)為復(fù)極化過程延遲而致動作電位時程(action potential duration,APD)延長等。其機制涉及到多種離子通道的改變和內(nèi)外向電流的平衡,包括L型Ca2+通道這種內(nèi)向離子流的變化。

在壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚中有多種神經(jīng)體液因素參與,其中血管緊張素II(Angiotensin II,Ang II)是重要的體液因子。研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ能調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中多種離子電流或通道的功能。Ang II調(diào)節(jié)各種跨膜離子流作用的存在,提示Ang II也可能促進(jìn)了心肌電生理重構(gòu)過程。事實上,Ang II被證實可增強培養(yǎng)心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白connexin43的表達(dá)[2]。這種縫隙連接蛋白在心肌細(xì)胞間動作電位傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。Ang II還可抑制心肌細(xì)胞Kv4.3通道蛋白的表達(dá),減少心肌鉀電流Ito;抑制心肌細(xì)胞Na+通道蛋白的表達(dá),減少心肌Na+電流密度[3]。但是,在Ang II誘使心肌細(xì)胞肥大時,心肌細(xì)胞L-型鈣通道的功能特征和分子表達(dá)水平又有何變化?這一問題目前并不清楚。

為了探索這一問題,本實驗擬在培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞上,觀察Ang II所誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞中L型Ca2+通道的功能特征和分子表達(dá)水平的變化,以便為闡明病理情況下心肌電生理重構(gòu)機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 YS-1300-V超凈工作臺、DGG-9249電熱恒溫干燥箱、CO2恒溫培養(yǎng)箱、Olympus IX71倒置顯微鏡、膜片鉗放大器、微電極拉制儀、低溫高速臺式離心機、PCR擴增儀、電泳槽和電泳儀及其他,包括 :純水機 、冰箱 、Sartorius BSII110S 、精密天平 、壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫水浴箱、三維操縱器、紫外分光光度儀、各種規(guī)格移液器、磁力攪拌器、pH測定計等。

1.1.2 藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hanks液、溴脫氧尿苷(BRDU)、多聚賴氨酸。

1.1.3 實驗用液的配制 配制用于調(diào)定溶液pH值的HCl、NaOH 、KOH:HCl(1 mol/L):36%HCl 4.31 ml,加純水至50 ml;NaOH(2 mmol/L):NaOH 4 g,加純水至50 ml,塑料器皿盛放;KOH(2 mmol/L):KOH 5.61 g,加純水至50 ml,塑料器皿盛放。DMEM培養(yǎng)基:將一瓶DMEM培養(yǎng)基干粉溶于950 ml三蒸水中,然后加入3.79NaHCO3,用1mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2,定容至1 L。種植培養(yǎng)液:在無菌條件下,將配好的DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清以9∶1比例混合。溴脫氧尿苷(BRDU)的配制:把它配成終濃度為1 mmol/L,然后l ml培養(yǎng)液中加入5 μ l。EDTA 的配制:精確稱取EDTA 0.01 g,溶于100 ml D-Hanks液中,高壓滅菌,4℃儲存。胰蛋白酶:精確稱取胰蛋白酶0.25 g,溶于100 ml D-Hanks液中,過濾分裝,-20℃儲存。標(biāo)準(zhǔn)臺氏液(mmol/L):NaCl 140,NaOH 2.3,KCl 5.4,CaCl21.8,MgCl21,HEPES 10,Glucose 10,pH 7.4(adjustedwith NaOH)。記錄L-型Ca2+電流時細(xì)胞外液(mmol/L):TEA Cl 135,MgCl21,CaCl210,HEPES 10,glucose 10,4-aminopyridine 3,CsCl 20,tetrodotoxin 0.03,pH 7.4(adjusted with CsOH)。記錄L-型Ca2+電流時電極內(nèi)液(mmol/L):CsCl 10,Cs-aspartate 120,MgCl23,HEPES 10,EGTA 15,CaCl21.8,glucose 10,creatine phosphate 3.6,MgATP 5,Tris-GTP 0.2,pH 7.2。DEPC水:1 000 ml超純水加1 ml DEPC。無RNA酶水:DEPC水(1∶1 000)室溫靜置12 h,20磅高壓消毒15 min。擴增引物:根據(jù)Entrez Nucleotide database中大鼠L-型Ca2+通道α 1C亞單位的基因序列,應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物 將健康體重250～300 g的SD大鼠雌、雄各一只,合籠喂養(yǎng)。待雌鼠懷孕后,將其從籠中取出,待產(chǎn)。分娩后新生1～2 d的健康SD大鼠仔鼠,用于實驗。

1.2.2 新生大鼠心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng) 取SD新生大鼠心室肌剪碎,0.1%胰蛋白酶反復(fù)消化,收集上清后轉(zhuǎn)移到DMEM培養(yǎng)基中離心,棄上清取細(xì)胞沉淀,加入含15%新生牛血清(NBS)的DMEM培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液,培養(yǎng)后純化心肌細(xì)胞,以2×105cells/bottle的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)72 h開始實驗。培養(yǎng)的前72 h加入0.1 mmol/L 5′-溴脫氧尿苷以抑制非心肌細(xì)胞增殖。

1.2.3 心肌細(xì)胞肥大的誘導(dǎo) 心肌細(xì)胞接種72 h后長成單層,換液時在培養(yǎng)基中加入Ang II至終濃度10-7mmol/L,之后每24 h換液并加藥一次,連續(xù)作用3 d。設(shè)空白對照組細(xì)胞不加Ang II。

1.2.4 心肌細(xì)胞總蛋白含量測定 本實驗參照南京建成生物工程公司考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測試劑盒說明測定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量,根據(jù)各瓶細(xì)胞數(shù),計算出每瓶細(xì)胞的總蛋白含量。蛋白含量(mg/m1)=(測定管OD值-空白管OD值)/標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值/(標(biāo)準(zhǔn)管濃度·稀釋倍數(shù))。

1.2.5 電生理研究 細(xì)胞置于倒置顯微鏡上的恒溫灌流槽中,溫度控制在22℃～24℃,先灌流標(biāo)準(zhǔn)臺氏液,記錄L-Ca2+電流時細(xì)胞外液成分,用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.4。記錄L-Ca2+電流時電極內(nèi)液成分(mmol/L):用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.4。在全細(xì)胞記錄模式下,信號經(jīng)Ag-AgCl電極引導(dǎo),由Axon 700B膜片鉗放大器放大,經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)采集數(shù)據(jù),并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。于細(xì)胞破膜后5min開始記錄ICa,L,使電極內(nèi)液和細(xì)胞內(nèi)液充分交換,減少了系統(tǒng)誤差。為消除細(xì)胞間誤差,電流值以電流密度(pA/pF)表示。以鉗制電壓為-50 mV,超級化-10 mV得到的細(xì)胞電容電流積分值,計算出細(xì)胞膜電容。細(xì)胞膜電容大小能反映細(xì)胞尺寸。

1.2.6 半定量RT-PCR 采用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈擴增反應(yīng)法檢測L-型Ca2+通道(α 1C亞單位)的mRNA表達(dá)量。通過總RNA的提取、RT(逆轉(zhuǎn)錄)、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))過程,取逆轉(zhuǎn)錄 cDNA產(chǎn)物2 μ l,加L-型Ca2+通道α 1C亞單位上下游引物各 2 μ l及內(nèi)參GAPDH上下游引物各 2 μ l,2×PCR Master Mix(Fermentas)12.5 μ l,滅菌水 2.5 μ l,總體積為 20 μ l。 擴增反應(yīng)條件為:94℃,30 s;58℃,40 s;72℃,1 min;30個循環(huán);完成全部循環(huán)后72℃10 min以達(dá)到充分延伸。取RT-PCR產(chǎn)物6 μ l進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠平板電泳。將電泳條帶圖像攝入凝膠成像分析系統(tǒng),保存為tiff格式圖片,供分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 7.5 software和Clampfit 10.0 software軟件分析電生理數(shù)據(jù)。電流強度的測定,以電流激活過程中剛出現(xiàn)時數(shù)值與電流達(dá)最大激活時數(shù)值之間的差值為準(zhǔn)。電流密度大小即為電流強度與膜電容的比值(pA/pF)。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用t檢驗和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組心肌細(xì)胞總蛋白含量和膜電容值的比較

與正常對照組相比,Ang II組心肌細(xì)胞的總蛋白含量明顯增高50%(P＜0.01);應(yīng)用Ang II 1型受體阻斷劑Losartan明顯使心肌細(xì)胞的總蛋白含量恢復(fù)至正常水平(表1)。與心肌細(xì)胞總蛋白含量改變一致,Ang II組心肌細(xì)胞的也要高于正常對照組(P＜0.01);Losartan同樣能使心肌細(xì)胞的膜電容值恢復(fù)正常。膜電容值的升高反映了心肌細(xì)胞尺寸的擴大。這些結(jié)果表明,Ang II誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型建立成功了。

Tab.1 Total protein content andmembrane capacitance of experimental group in cardiomyocytes(±s)

Tab.1 Total protein content andmembrane capacitance of experimental group in cardiomyocytes(±s)

AngⅡ:AngiotensinⅡ**P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs AngⅡgroup

Group n Total protein content(g/109cells)Membrane capacitance(pF)Normal 8 1.78±0.26 88±9 AngⅡ 9 2.67±0.32** 129±12**Losartan 7 1.88±0.28## 91±11##

2.2 Ang II誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中L-型Ca2+電流密度的改變

在形成全細(xì)胞封接狀態(tài)后,將細(xì)胞鉗制在-50 mV,給予指令電壓從-40 mV～+80 mV,波寬為300 ms的刺激,可記錄到一系列的 ICa,L。當(dāng)加入nifedipine(3 μ mol/L),再給予上述刺激后 ,可見該電流被迅速抑制,說明該電流為L-型Ca2+電流。圖1是實驗中記錄的典型L-型Ca2+電流曲線。實驗連續(xù)記錄ICa,L15 min,未見明顯的“run-dowm”現(xiàn)象。

如圖2A所見,Ang II組心肌細(xì)胞的L-型Ca2+電流密度在-20～+40 mV范圍內(nèi)明顯高于正常組。其中,0 mV處Ang II組L-型Ca2+電流密度(6.13 pA/pF)比正常組(4.03 pA/pF)增高52.2%(P＜0.01)。但L-型Ca2+電流激活電位和翻轉(zhuǎn)電位并沒有改變。Losartan可以使大鼠心肌細(xì)胞L-型Ca2+電流密度恢復(fù)至正常組水平。

Fig.1 Typical curve of L-type Ca2+currents

2.3 Ang II誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中L-型Ca2+通道動力學(xué)參數(shù)變化

穩(wěn)態(tài)激活特征:記錄ICa,L穩(wěn)態(tài)激活曲線時刺激方案與記錄I-V曲線的方案相同。穩(wěn)態(tài)激活曲線是將I-V曲線轉(zhuǎn)換成膜電導(dǎo)后得到,用 Boltzmann方程:G/Gmax=1/{1+exp[(V-Va)/k]}進(jìn)行擬合。其中,G是膜電壓為V時的膜電導(dǎo),Gmax為最大膜電導(dǎo),Va為半數(shù)激活電壓,k為斜率因子,G=I/(VErev),I為對應(yīng)膜電壓V時的峰電流,Erev為通過I-V曲線測得的反轉(zhuǎn)電位。

如同圖 2B所顯示,正常組、Ang II組、Losartan組三組的ICa,L激活曲線特征沒有明顯不同。三組的半數(shù)激活電壓Va分別為(-7.86±1.03)mV、(-8.15±1.21)mV、(-8.06±1.18)mV(P＞0.05)。

穩(wěn)態(tài)失活特征:記錄ICa,L穩(wěn)態(tài)失活曲線應(yīng)用雙脈沖刺激,鉗制電壓為-50 mV,條件脈沖從-60 mV開始,階躍10 mV,時間3 000 ms;隨后測試脈沖為10 mV,時間300 ms。穩(wěn)態(tài)失活曲線是用Boltzmann方程:I/Imax=1/{1+exp[(V-Vi)/k]}進(jìn)行擬合。其中,I為測試脈沖引出的峰電流,Imax為測試脈沖引出的最大峰電流,V為條件脈沖電壓,Vi為半數(shù)失活電壓,k為斜率因子。結(jié)果顯示,正常組、Ang II組、Losartan組三組的失活曲線特征相近(圖3)。三組的半數(shù)失活電壓Vi分別為(-24.86±3.65)mV、(-25.55±4.01)mV 、(-24.31±3.87)mV(P＞0.05)。

Fig.2 Activation and I-V curves of L-type Ca2+currents in cardiomyocytes of three groups

Fig.3 Inactivation curve of L-type Ca2+currentsin cardiocytes of three groups

失活后復(fù)活特征:記錄ICa,L穩(wěn)態(tài)失活后恢復(fù)曲線采用雙脈沖刺激,鉗制電壓為-50 mV,給予+10 mV、時間為200 ms(P1)和200 ms(P2)的兩個方波刺激,兩刺激間隔時間為從50 ms開始,每次遞增50 ms,直至750 ms。分別記錄P1和P2對應(yīng)的峰電流。計算復(fù)活電流指數(shù)(P2/P1)。以復(fù)活電流指數(shù)對兩刺激間隔時程作復(fù)活曲線。并用單指數(shù)方程:P2/P1=A1 exp(-t/τ)+A0進(jìn)行擬合。求出復(fù)活時間常數(shù)τ。結(jié)果顯示,正常組、Ang II組、Losartan組三組的失活后恢復(fù)曲線特征相近(圖4)。三組的復(fù)活時間常數(shù)分別為(115±13)ms、(120±25)ms、(118±24)ms(P＞0.05)。

2.4 Ang II誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中L-型Ca2+通道α 1C亞單位mRNA表達(dá)的改變

為了確認(rèn)Ang II誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中L-型Ca2+通道分子水平上的改變,我們采用RT-PCR檢測了心肌細(xì)胞中L-型Ca2+通道α 1C亞單位的mRNA表達(dá)量。Ang II組心肌細(xì)胞中α 1C亞單位的mRNA表達(dá)量明顯高于正常組圖5A。為了進(jìn)一步的實時定量檢測α 1C亞單位的mRNA表達(dá)量,我們又做了Real-time PCR(實時定量PCR),定量檢測了α 1C亞單位的表達(dá)量。實時定量PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步證實,Ang II組心肌細(xì)胞中α 1C亞單位的mRNA表達(dá)明顯增高,高于正常組56.0%(圖5B)。

Fig.4 Recovery curve of L-type Ca2+currents in cardiocytes of three groups

3 討論

3.1 Ang II誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中L-型Ca2+通道的功能在分子水平表達(dá)上的改變

盡管目前已有一些實驗證實,Ang II可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞ICa,L電流[4,5]。但是,這些實驗并沒有探討Ang II對L-型Ca2+通道表達(dá)的影響。當(dāng)前研究的主要新發(fā)現(xiàn)是,Ang II在引起新生大鼠心肌肥大的同時,增加心肌細(xì)胞 ICa,L電流和L-型Ca2+通道α 1C亞單位mRNA表達(dá)。

Fig.5 mR NA expression of L-type Ca2+channel α 1C subunits in cardiocytes of three groups

L-型Ca2+通道主要是由α亞單位和β亞單位構(gòu)成。單獨α亞單位表達(dá)即可形成功能性L-型Ca2+通道孔,是主要功能亞單位;β亞單位是調(diào)節(jié)性亞單位,它與α亞單位共表達(dá),可以調(diào)節(jié)L-型Ca2+通道的功能特征。目前研究發(fā)現(xiàn),心臟組織中并無其他α亞單位類型。心臟的β亞單位主要是β2亞單位。基于上述發(fā)現(xiàn),本實驗只檢測了培養(yǎng)新生鼠心室肌細(xì)胞的L-型Ca2+通道α 1C亞單位的表達(dá)。

本實驗研究中,Ang II對新生大鼠心肌細(xì)胞ICa,L電流的影響與其調(diào)節(jié)L-型Ca2+通道α 1C亞單位表達(dá)的作用相互一致。Ang II所誘導(dǎo)的ICa,L電流密度增加可能與其促進(jìn)L-型Ca2+通道α 1C亞單位表達(dá)增加有關(guān)。另外,Ang II雖然增加了心肌細(xì)胞ICa,L電流密度,但對 L-型Ca2+通道的激活、失活、復(fù)活等通道門控動力學(xué)特征并無影響。因而,Ang II可能只是增加α 1C亞單位的表達(dá)量,而對心肌細(xì)胞L-型Ca2+通道的其它亞單位構(gòu)成類型并沒有影響。

在心肌細(xì)胞中,Ang II的作用受體至少有兩種,即血管緊張素II 1型受體(angiotensin receptor type 1,AT1R)和血管緊張素II 2型受體(angiotensin receptor type 2,AT2R)。大部分Ang II的作用是由AT1R介導(dǎo)的。本研究發(fā)現(xiàn),Ang II增加新生鼠心室肌細(xì)胞ICa,L電流密度和L-型Ca2+通道α 1C亞單位表達(dá)的作用也是由AT1R介導(dǎo)的。故應(yīng)用AT1R拮抗劑losartan能抑制的這些作用。

3.2 Ang II增加 ICa,L電流密度和L-型Ca2+通道表達(dá)的可能意義

Ang II對ICa,L電流密度和L-型Ca2+通道表達(dá)的增強,可能增加心肌細(xì)胞動作電位時期跨細(xì)胞膜內(nèi)流的 Ca2+量,而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+負(fù)荷。這種Ca2+負(fù)荷加重(或稱Ca2+超載)可以導(dǎo)致觸發(fā)活動發(fā)生,引起心律失常[7]。這也許是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)和血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor antagonist,ARB)能夠?qū)κ倚孕穆墒С＞哂幸欢ǚ乐巫饔玫脑騕7,8]。

[1]Koren M J,Devereux R B,Casale P N,et al.Relation of left ventricular mass and geometry to morbidity and mortality in uncomplicated essential hypertension[J].Ann InternMed,1991:114(5):345-352.

[2]Dodge S M,Beardslee M A,Darrow B J,et al.Effects of angiotensin II on expression of the gap junction channel protein connexin43 in neonatal rat ventricular myocytes[J].J Am Coll Cardiol,1998,32(3):800-807.

[3]Shang L L,Sanyal S,PfahnlA E,et al.NF-kappaB-dependent transcriptional regulation of the cardiac scn5a sodium channel by angiotensin II[J].Am J Physiol Cell Physiol,2008,294(1):C372-379.

[4]Bkaily G,Sculptoreanu A,Wang S,et al.Angiotensin II-induced increase of T-type Ca2+current and decrease of L-type Ca2+current in heart cells[J].Peptides,2005,26(8):1410-1417.

[5]Tristani-Firouzi M,Chen J,Mitcheson JS,et al.Molecular biology of K+channels and their role in cardiac arrhythmias[J].Am J Med,2001,110(1):50-59.

[6]Song L S,Guia A,Muth J N,et al.Ca(2+)signaling in cardiac myocytes overexpressing the alpha(1)subunit of L-type Ca(2+)channe[J].Circ Res,2002,90(2):174-181.

[7] Anvari A,Türel Z,Schmidt A,et al.Angiotensin-converting enzyme and angiotensin II receptor 1 polymorphism in coronary disease and malignant ventricular arrhythmias[J].Ardiovasc Res,1999,43(4):879-883.

[8]Hiura N,Wakatuki T,Yamamoto T,et al.Effects of angiotensin II type I receptor antagonist(candesartan)in preventing fatal ventricular arrhythmias in dogs during acute myocardial ischemia and reperfusion[J].J Cardiovasc Pharmacol,2001,38(5):729-736.