林志堅(jiān)，曾文雙，吳 軍

阿司匹林、氯吡格雷及西洛他唑是臨床上最常用于缺血性心腦血管病預(yù)防和治療的抗血小板藥物。然而，這些藥物存在一定的副作用，如消化道出血甚至顱內(nèi)出血，而且還可能會(huì)出現(xiàn)抗血小板藥物抵抗［1］。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者開(kāi)始研發(fā)新型抗血小板藥物［2］，如三氟柳、Parsugrel、坎格雷洛等，這些新型抗血小板藥物價(jià)格昂貴、臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)不成熟，而且仍然不能克服出血的副作用。傳統(tǒng)中藥丹參被證實(shí)可以有效地抑制血栓形成［3］，且無(wú)明顯副作用，價(jià)格低廉，但丹參各種成分的抗血栓機(jī)制尚未明確。丹酚酸B（salvianolic acid B，SA-B）是丹參最主要的水溶性有效成分，在丹參總酚酸中含量最高，約占70%。本研究利用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定血小板膜P-選擇素陽(yáng)性百分率的方法，觀察不同濃度SA-B對(duì)經(jīng)膠原作用的小鼠體外血小板膜P-選擇素表達(dá)的影響，探討SA-B對(duì)小鼠血小板活化功能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性昆明小鼠（8周齡，體重35 g～40 g），清潔級(jí)，50只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為5組：對(duì)照組，模型組，低濃度SA-B組、中濃度SA-B組、高濃度SA-B，每組10只。

1.1.2 主要藥品及試劑 丹酚酸-B，淡黃色粉針劑，純度大于98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所／臨用前用生理鹽水配制成不同濃度：1 200 mg／L，2 400 mg／L，3 600 mg／L；膠原（美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品）；藻紅蛋白標(biāo)記的抗小鼠IgG（IgG-PE），異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD61單克隆抗體（CD61-FITC），藻紅蛋白標(biāo)記的抗小鼠CD62P單克隆抗體（CD62P-PE）（美國(guó)BD公司）。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀（Epics XL型，美國(guó)Beckman Coulter公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)GNP-9160，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造公司）。

1.2 方法

1.2.1 采血 采用眼球摘除法取全血于3.8%枸櫞酸鈉抗凝EP管中。

1.2.2 膠原激活 取對(duì)照組小鼠全血10μL加入生理鹽水10 μL（分別取2管），混勻，37℃孵育15 min；分別取其余各組小鼠全血10μL加入200μg／m L膠原10μL（美國(guó)Sigma公司，膠原終濃度為100μg／m L，分別取2管），混勻，37℃孵育15 min。

1.2.3 藥物作用 在低濃度SA-B組全血加入1 200 mg／L SA-B 10μL（SA-B終濃度為400 mg／L），在中濃度SA-B組加入2 400 mg／L SA-B 10μL（SA-B終濃度為800 mg／L），在高濃度SA-B組加入3 600 mg／L SA-B 10μL（SA-B終濃度為1 200 mg／L），模型組加入等量的生理鹽水，37℃孵育30 min。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測(cè) 在上述經(jīng)過(guò)處理的標(biāo)本中，對(duì)照管加入抗小鼠CD61-FITC、抗小鼠IgG-PE，試驗(yàn)管加入抗小鼠CD61-FITC、CD62P-PE?；靹蚴覝乇芄夥跤?0 min，然后再加入1 mL冷的磷酸緩沖液（PBS）。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以CD61-FITC和側(cè)散射光散點(diǎn)圖設(shè)血小板門，測(cè)定血小板膜CD62P（P-選擇素）表達(dá)陽(yáng)性百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

模型組P-選擇素高于對(duì)照組（P＜0.01）；低濃度SA-B組、中濃度SA-B組、高濃度SA-B組P-選擇素均低于模型組（P＜0.05）；不同濃度SA-B組P-選擇素隨SA-B濃度的增加而減少（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠P-選擇素的比較（±s） %

表1 各組小鼠P-選擇素的比較（±s） %

組別 n P-選擇素對(duì)照組10 9.37±1.29模型組 10 53.79±5.781）低濃度SA-B組 10 48.24±4.662）中濃度SA-B組 10 44.67±2.382）3）高濃度SA-B組 10 40.24±6.092）3）4）與對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05；與低濃度SA-B組比較，3）P＜0.05；與中濃度SA-B組比較，4）P＜0.05

3 討 論

傳統(tǒng)中藥丹參被證實(shí)可以有效抑制血栓形成，對(duì)心血管、神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，且無(wú)明顯副作用，價(jià)格低廉，廣泛應(yīng)用于治療缺血性心腦血管疾病［3］。丹參的主要化學(xué)成分包括脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物，丹參各種成分的抗血栓機(jī)制尚未明確［4］。丹酚酸B是丹參最主要的有效活性成分［5］。

靜息狀態(tài)下，P-選擇素主要存在于血小板α顆粒內(nèi)，血小板活化后，α顆粒與血小板質(zhì)膜融合，P-選擇素表達(dá)血小板質(zhì)膜表面［6］，成為血小板活化的一個(gè)特征性指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，加入膠原后，血小板膜P-選擇素陽(yáng)性率明顯升高，提示膠原可刺激血小板活化。膠原是啟動(dòng)血小板黏附、聚集過(guò)程最強(qiáng)有力的血管壁成分。血小板有2個(gè)受體在血小板-膠原相互作用起重要作用，即糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）和整合素α2β1。血小板特異性GPⅥ（62 k Da）是血小板膠原特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，它與膠原的親和力低，不能單獨(dú)介導(dǎo)穩(wěn)定的血小板黏附，但對(duì)血小板穩(wěn)定的黏附到膠原上起關(guān)鍵作用，因?yàn)樗ㄟ^(guò)結(jié)合的FcRγ鏈誘導(dǎo)強(qiáng)大的信號(hào)途徑；整合素α2β1經(jīng)過(guò)活化后由低親和力構(gòu)象轉(zhuǎn)化為高親和力構(gòu)象，膠原結(jié)合到整合素α2β1促進(jìn)血小板活化和緊密黏附途徑的下游步驟的進(jìn)行。

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的SA-B組P-選擇素均低于模型組，P-選擇素隨SA-B濃度的增加而減少，不同濃度的SA-B對(duì)膠原引起的血小板活化具有抑制作用，SA-B濃度越高，這種抑制作用越強(qiáng)。因此，可以認(rèn)為，SA-B抗血栓的機(jī)制可能與其抑制膠原引起的血小板活化有關(guān)。另外，P-選擇素與其配體結(jié)合后起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，活化靶細(xì)胞或改變其功能狀態(tài)，從而介導(dǎo)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞-血小板間反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷［7］，SAB對(duì)P-選擇素具有抑制作用，減少炎癥反應(yīng)對(duì)心血管、神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

本研究的不足之處在于僅測(cè)定P-選擇素，而未檢測(cè)血小板膜糖蛋白GPⅡb／Ⅲa纖維蛋白原受體。目前標(biāo)記小鼠GPⅡb／Ⅲa纖維蛋白原受體的熒光抗體為JON／A-PE或JON／A-FITC［8］，該試劑價(jià)格較為昂貴且不易獲得，這是本研究不能檢測(cè)GPⅡb／Ⅲa纖維蛋白原受體的原因。GPⅡb／Ⅲa與纖維蛋白原的結(jié)合是血小板聚集的最后通路［9］。GPⅡb／Ⅲa與纖維蛋白原結(jié)合，引起血小板聚集，促進(jìn)血栓形成，在腦缺血缺氧性損傷起重要的作用。

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