李 娟 張艷萍 張麗紅 蓋 凌 邱 毅 魏 斌 王洪巖 吳愛華 王磊光

山東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，山東省優(yōu)生技術(shù)重點實驗室(濟南，250002)

人胚胎干細胞(hESC)是一種源于人囊胚內(nèi)細胞團(ICM)，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)獲得的原始全能干細胞。自1998年人類首次利用體外受精胚胎建立ESC 系后［1，2］，各國科學(xué)家相繼建立了約 120 株hESC。hESC系的建立不僅可用于體外研究人類胚胎的發(fā)生發(fā)育過程，而且可通過定向分化誘導(dǎo)產(chǎn)生各種特化的細胞和組織，用于治療多種臨床疾病。在hESC建系和維持過程中，胚胎材料來源、ICM分離、擴增傳代等均為難點。本研究擬利用體外受精-胚胎移植過程中冷凍10年以上的卵裂期胚胎，探討經(jīng)體外序貫共培養(yǎng)至囊胚期，建立hESC系的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

序貫培養(yǎng)液(IVC，美國)，絲裂霉素C、L-谷氨酰胺(Sigma，美國)，胎牛血清(四季青，杭州)，Knockout DMEM培養(yǎng)基、胰酶、非必需氨基酸、二巰基乙醇(Gibco，美國)，白血病抑制因子(LIF，Chemicon，美國)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，RD，美國)，堿性磷酸酶(AKP)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Oct-4)試劑盒(博奧森生物技術(shù)有限公司，北京)。解剖顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(Nikon，日本)，CO2培養(yǎng)箱(Galaxy，英國)。

1.2 方法

1.2.1 人卵裂期胚胎 長期冷凍的卵裂期胚胎由山東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所生殖中心提供，經(jīng)倫理委員會討論通過，并經(jīng)接受助孕且已生育健康子女夫婦知情同意。共收集13枚冷凍卵裂期胚胎。

1.2.2 人卵丘細胞共培養(yǎng)體系的制備及胚胎序貫共培養(yǎng) 人卵丘細胞取自因男方因素不育需做卵胞漿內(nèi)單精子注射的女性患者，取卵后獲得的卵-冠-丘復(fù)合體用80U/ml透明質(zhì)酸酶分離卵子和卵丘細胞，收集卵子用于卵胞漿內(nèi)單精子注射;卵丘細胞迅速收集在離心管中，加卵裂期序貫培養(yǎng)液4～6ml混勻，1 000rpm/min離心5min，棄上清，沉淀加序貫培養(yǎng)液調(diào)密度為5×104/ml，制成50μl/滴的人卵丘細胞液滴，置入37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)卵丘細胞貼壁伸展后，更換序貫培養(yǎng)液，用于解凍后胚胎共培養(yǎng)。常規(guī)解凍胚胎，放入制備好的單層卵丘細胞飼養(yǎng)層共培養(yǎng)，2～8細胞期胚胎用卵裂期培養(yǎng)液，8細胞后更換囊胚培養(yǎng)液，培養(yǎng)至囊胚期。

1.2.3 飼養(yǎng)層和條件培養(yǎng)基的制備 取孕13.5d昆明小鼠胚胎，去除頭、四肢及內(nèi)臟，眼科剪剪軀干部分成約1mm3組織塊，0.25%胰蛋白酶室溫消化3～5min后，成纖維細胞培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打混勻，收集胎鼠成纖維細胞(MEF)并接種在培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞鋪滿80%皿底時，即可進行傳代。第2～3代MEF鋪滿80%皿底時，用含10μg/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3h，常規(guī)胰酶消化，并種植單細胞懸液到預(yù)先用明膠處理過的培養(yǎng)皿中，細胞貼壁伸展后，用于ESC培養(yǎng)。條件培養(yǎng)基的制備:取2代MEF飼養(yǎng)細胞，以5×104/ml密度種植于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入ESC培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);3d后取上清，5 000rpm/min離心10min;取上清分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 全胚培養(yǎng)法分離囊胚ICM 囊胚經(jīng)機械輔助孵出，直接接種于制備好的 MEF飼養(yǎng)層上，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，移入前1～3h MEF飼養(yǎng)層更換ESC培養(yǎng)液;逐日觀察，每天半量換液，胚胎1～2d開始貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)5～6d后每天換含20%MEF條件培養(yǎng)基的ESC培養(yǎng)液，7～10d后，部分ICM逐漸隆起致密，呈克隆樣生長。

1.2.5 干細胞培養(yǎng) ICM呈明顯克隆樣生長時，玻璃針挑出ICM，機械分割后，接種于含新飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿中置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，離散的hESC培養(yǎng)1 d左右細胞開始貼壁;2d后待其充分貼壁后每天半量更換培養(yǎng)液;繼續(xù)培養(yǎng)4～6d后，見島丘狀或鳥巢狀ESC樣集落出現(xiàn)并明顯增大，選擇折光性增強、形態(tài)典型、周圍沒有分化跡象、生長旺盛的ESC集落，機械分割成小塊，每塊約含干細胞100～300個左右，重新接種傳代，并常規(guī)對hESC進行玻璃化冷凍。

1.2.6 hESC的鑒定 ①生物學(xué)特性觀察:倒置顯微鏡下觀察胚胎生長和hESC集落的形態(tài)特征及生長狀態(tài);②AKP組織化學(xué)染色鑒定:按AKP試劑盒說明操作，鏡下觀察AKP染色紫藍色為陽性，AKP染色呈成淡黃色或無色為陰性;③Oct-4免疫熒光染色;④染色體檢查。

1.2.7 ESC體外誘導(dǎo)分化 選取傳10代以上生長旺盛、形態(tài)典型的ESC集落，機械分割成小團，毛細玻璃管吸取并放在預(yù)先制備好的培養(yǎng)皿蓋上，加不含LIF的ESC培養(yǎng)液滴，翻轉(zhuǎn)皿蓋使液滴懸掛在蓋子上，置37℃ ，5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，定時觀察，隔天半量換液。

2 結(jié)果

2.1 胚胎體外序貫共培養(yǎng)和干細胞分離與培養(yǎng)結(jié)果

13枚卵裂期胚胎復(fù)蘇，9枚存活，其中Ⅱ級胚胎4枚，Ⅲ級胚胎5枚，經(jīng)序貫共培養(yǎng)3～5d，有6枚發(fā)育至囊胚期(圖1)，機械輔助孵出后移入制備好的MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng);7～15d后，3枚ICM有明顯隆起形成原代克隆(圖2)，采用機械法傳代培養(yǎng)，2枚傳至2～3代后分化，1枚成功建系傳至10代以上。建系的hESC集落呈典型鳥巢狀生長，集落內(nèi)細胞界限清楚、核大、核仁清晰、細胞核/細胞質(zhì)比例高，集落周邊與MEF飼養(yǎng)層界限清楚，無分化跡象(圖3、4)。

2.2 hESC的AKP組織化學(xué)染色鑒定

鏡下觀察hESC集落呈AKP陽性，紫藍色著色;MEF呈陰性，淡黃色著色或無色(圖5)。

2.3 Oct-4免疫熒光染色鑒定與染色體檢查

免疫熒光染色檢測陽性表達hESC特異性轉(zhuǎn)錄因子Oct4(圖6)，將傳至第10代以上的ESC用胰酶消化形成單細胞懸液，采用常規(guī)G顯帶法分析細胞染色體核型，核型為46，XY(圖7)。

2.4 hESC體外分化能力的鑒定

hESC經(jīng)過6～10d的懸浮培養(yǎng)，形成擬胚體(EBs)，貼壁培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)EBs外向性生長，周圍分化的細胞形態(tài)呈多樣性;培養(yǎng)22d后形成心肌樣細胞，有自發(fā)搏動。

3 討論

hESC是了解人胚胎發(fā)育機制和實現(xiàn)治療性克隆的前提，hESC的體外分離培養(yǎng)受多種因素影響。時至目前，hESC來源引發(fā)的倫理問題以及ICM分離、擴增傳代、凍存復(fù)蘇等技術(shù)難點依然限制hESC大量體外擴增、培養(yǎng)及進行相關(guān)研究。經(jīng)體外受精后發(fā)育至囊胚階段的優(yōu)質(zhì)胚胎是hESC成功建系的最佳選擇，但由于受國家法律和倫理學(xué)的限制，不能獲取足夠的優(yōu)質(zhì)胚胎，本研究利用體外受精-胚胎移植后長期保存的冷凍胚胎，經(jīng)體外序貫共培養(yǎng)，改善胚胎體外培養(yǎng)環(huán)境，促進胚胎體外發(fā)育［3］;結(jié)合輔助孵出技術(shù)，采用全胚培養(yǎng)從6枚囊胚中分離到3枚完整ICM原代克隆，并最終獲得1個干細胞系，建系率 16.67% ，與已報道的建系率［4，5］相近。

從囊胚中分離ICM是hESC建系的第一步，也是最關(guān)鍵一步［6］，常用的ICM主要分離方法包括全胚培養(yǎng)法與免疫外科法。本研究對囊胚期胚胎采用機械輔助孵出后全胚培養(yǎng)，并在隨后的原代培養(yǎng)中適時加入含20%MEF條件培養(yǎng)基的干細胞培養(yǎng)液，避免了MEF飼養(yǎng)層因老化而分泌不足，有助于ICM增殖，待ICM呈柱狀突起且擴張迅速時，機械挑取ICM用于干細胞建系。此法操作簡便易行，并且對細胞的損傷較小，能最大限度地保留ICM活力，有助于hESC成功建系［7］。但通過全胚培養(yǎng)法分離ICM獲得的hES易混雜滋養(yǎng)層細胞，需要經(jīng)過傳代篩選的過程才能獲得較純hESC系，再者由于受滋養(yǎng)層細胞的干擾易導(dǎo)致ICM分化。

ICM的離散時機也非常重要。傳代時間太早或太晚都易導(dǎo)致分化，無法獲得hESC。本研究在胚胎種植后增殖培養(yǎng)7～15d時，一旦發(fā)現(xiàn)ICM隆起致密且呈柱狀生長時，挑取ICM易獲得典型的hESC樣克隆集落，與文獻［8，9］報道一致。

本研究為保持干細胞純化采用機械法傳代［10］。建系初期選擇機械法傳代，可有選擇地去除混雜的滋養(yǎng)層細胞及分化細胞，純化hESC系;在后續(xù)培養(yǎng)中，機械法能有選擇地對未分化集落進行直觀操作，能長期維持hESC的正常核型，避免酶消化法導(dǎo)致的細胞死亡，并避免長期酶消化傳代所導(dǎo)致的染色體變異及分化。有研究認為酶在ESC傳代時可能會通過影響ESC的體外自我更新信號通路，導(dǎo)致其分化［11］。但機械法傳代不同于酶消化法傳代，需要在相對開放的環(huán)境下進行，對操作者技術(shù)及操作環(huán)境有著非常嚴格的要求，以有效維持無菌環(huán)境和無菌培養(yǎng)體系，而且隨著傳代增多工作量會大幅度提高。怎樣選擇更有效的傳代方法，還有待于進一步探討。

我國人口分布面廣，人群遺傳背景差異顯著，急需建立更多的細胞系來滿足未來的研究和應(yīng)用。hESC培養(yǎng)體系存在培養(yǎng)環(huán)境要求較高、技術(shù)環(huán)節(jié)多、操作難度大、易污染等問題，而且其自我更新和多向分化潛能的機制有待進一步研究，因此建立完善有效的hESC培養(yǎng)體系尤為重要。本研究初步嘗試利用長期冷凍的廢棄胚胎采用卵丘細胞序貫共培養(yǎng)改善胚胎體外培養(yǎng)條件，提高胚胎體外發(fā)育潛力，有利于建立hESC系，從而為后續(xù)的研究工作提供材料平臺。

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3 李娟，蓋凌，魏斌，等.3種體細胞共培養(yǎng)體系對昆明鼠早期胚胎體外發(fā)育潛力的影響研究［J］.中國計劃生育學(xué)雜志，2012，20(7):455-458.

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