牟建英 ，錢(qián)玉梅，任民，劉艷華，張興偉，王志德，潘應(yīng)花

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/國(guó)家煙草行業(yè)煙草病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,青島 266101；

2 農(nóng)業(yè)部煙草類(lèi)作物質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；

3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

煙草白粉病是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC）侵染引起的煙草主要葉部病害之一。白粉病侵染的葉片在調(diào)制過(guò)程中病斑會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大，葉片薄如紙狀，易破碎，缺乏彈性，影響煙葉質(zhì)量[1]。由于我國(guó)大面積種植的烤煙品種均不抗白粉病[1]，化學(xué)防治仍是白粉病的主要防治方法，除了增加人力、物力投入，還會(huì)引起環(huán)境污染等生態(tài)問(wèn)題，培育抗病品種是防治煙草白粉病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。開(kāi)展抗性基因的QTL定位，對(duì)煙草白粉病抗性基因進(jìn)行分子生物學(xué)研究，對(duì)于明確煙草白粉病的抗病機(jī)理和分子標(biāo)記輔助選擇育種具有重要意義。

煙草白粉病抗性遺傳規(guī)律，以及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面的研究較少。李華麗等[2]以臺(tái)煙7號(hào)和白肋21作為雜交親本，后代自交衍生的127個(gè)F2和F2:3家系為材料，檢測(cè)到1個(gè)煙草白粉病加性QTL，貢獻(xiàn)率為11.63%，本文利用2317對(duì)SSR引物對(duì)煙草白粉病抗性基因進(jìn)行QTL分析，為煙草抗白粉病分子標(biāo)記輔助選擇育種和抗白粉病相關(guān)基因的克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

母本臺(tái)煙7號(hào)是抗白粉病品種，父本NC89是感白粉病品種。臺(tái)煙7號(hào)與NC89雜交得到F1，F(xiàn)1自交得到285株F2單株。接種鑒定病原菌為二孢白粉菌Erysiphe cichoracearum DC。所用實(shí)驗(yàn)材料均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所。

1.2 煙草白粉病抗性的接種鑒定

對(duì)煙草白粉病抗性的苗期鑒定于2012年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室內(nèi)完成。鑒定材料包括親本、F1、F2，煙苗5-6葉期采用噴霧接種法接種，孢子懸浮液濃度為1.25×107個(gè)/mL，接種20天后調(diào)查病情。

根據(jù)GB/T 23222-2008中煙草白粉病病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，逐株以葉片為單位分級(jí)調(diào)查。

0級(jí)：無(wú)病斑；

1級(jí)：病斑面積占葉片面積的5%以下；

3級(jí)：病斑面積占葉片面積的6%～10%；

5級(jí)：病斑面積占葉片面積的11%～20%；

7級(jí)：病斑面積占葉片面積的21%～40%；

9級(jí)：病斑面積占葉片面積的41%以上。

群體抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：

高抗：0≤病情指數(shù)≤15；

抗?。?5＜病情指數(shù)≤35；

中抗：35＜病情指數(shù)≤55；

感?。?5＜病情指數(shù)≤80；

高感：80＜病情指數(shù)≤100。

病情指數(shù)（DI）：DI=∑（每個(gè)病級(jí)葉片數(shù)×病級(jí)數(shù)）/（葉片總數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）×100。

1.3 DNA提取及SSR體系

DNA提取參照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒提取方法，略有改動(dòng)。

SSR引物采用2011年Bindler等[3]發(fā)布的煙草高密度遺傳連鎖圖譜，共計(jì)2317對(duì)，由上海生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：總體積為10 μL，包括Green Master 2×Mix 5 μL，DNA（30-50 ng·μL-1）1 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各 0.5 μL，ddH2O 3μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。其中退火溫度因序列不同略有調(diào)整。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠800V恒電壓電泳分離，銀染顯色后用燈箱進(jìn)行觀察。

1.4 SSR標(biāo)記篩選、連鎖圖構(gòu)建與QTL定位

從2317對(duì)SSR引物中篩選在兩親本間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物，并對(duì)部分F2單株進(jìn)行分析，進(jìn)一步篩選出能擴(kuò)增出清晰可統(tǒng)計(jì)帶型的SSR引物，最后利用得到的SSR引物對(duì)285株F2單株進(jìn)行分析。

用OneMap軟件包對(duì)F2群體的SSR標(biāo)記分型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，用MapDraw V2.1[4]繪制遺傳連鎖圖。

利用WinQTLCart2.5 軟件進(jìn)行QTL分析[5]，利用置換檢測(cè)1000次重復(fù)，估算基因組范圍內(nèi)α=0.05水平上的LOD值。本研究中使用的閾值為L(zhǎng)OD≥2.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草白粉病的抗性鑒定結(jié)果

母本臺(tái)煙7號(hào)表現(xiàn)為對(duì)白粉病免疫，父本NC89表現(xiàn)為感白粉病，平均病情指數(shù)為74.24， F1表現(xiàn)為感白粉病，平均病情指數(shù)為76.81， F2表現(xiàn)出抗病性分離，其病情指數(shù)分布如圖1。F2群體病情指數(shù)基本符合正態(tài)分布，可以用于QTL分析。

圖1 F2群體病情指數(shù)分布圖

2.2 SSR標(biāo)記連鎖群的構(gòu)建

利用親本臺(tái)煙7號(hào)和NC89對(duì)2317對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，共得到112對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)率為4.83%。用篩選出的112對(duì)多態(tài)性引物對(duì)部分F2群體單株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選擇61對(duì)多態(tài)顯著且擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物。用這61對(duì)引物對(duì)F2群體的285個(gè)單株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，記錄帶型。

利用OneMap軟件在LOD≥3的條件下構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。該圖譜全長(zhǎng)481.8 cm ，包含45個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，標(biāo)記間平均遺傳距離為10.7 cm 。圖譜共包含15個(gè)連鎖群，每個(gè)連鎖群平均有3個(gè)標(biāo)記，其中最長(zhǎng)連鎖群長(zhǎng)64.7 cm ，最短的為5.2 cm 。另外有16個(gè)標(biāo)記未整合到該圖譜上。

2.3 煙草白粉病抗性基因的QTL

利用WinQTLCart2.5 軟件，復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)煙草白粉病抗性QTL進(jìn)行定位。在14號(hào)連鎖群上檢測(cè)到1個(gè)QTL,暫命名為pm14.1，其加性效應(yīng)為-14.38，貢獻(xiàn)率為21.02%，LOD值為9.45，為減效位點(diǎn)，增效基因來(lái)自于感病的父本NC89。Pm14.1 與引物52725 緊密連鎖，遺傳距離為1.01 cm。

圖2 臺(tái)煙7號(hào)×NC89 F2群體SSR標(biāo)記連鎖群的構(gòu)建及煙草白粉病抗性基因的QTL定位

3 討論

目前，關(guān)于煙草白粉病抗性遺傳規(guī)律的研究很少，而且結(jié)果也不盡一致。主要觀點(diǎn)有：Kokubu品種表現(xiàn)為重復(fù)隱性等位基因控制的遺傳[1]；Hicks55、Pobeda3、TB22三個(gè)品種的抗性均表現(xiàn)為顯性單基因遺傳[1]；塘蓬抗性表現(xiàn)為隱性基因遺傳[6]。導(dǎo)致不同結(jié)果的原因可能有以下幾方面：首先，煙草品種不同，其抗性遺傳機(jī)制可能不同；其次，煙草白粉菌種類(lèi)不同，接種時(shí)可能是病菌混合體【瓜單囊殼〔Sphaerotheca fuliginea（Schlecht.）Poll.〕，二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.）】而不是單孢培養(yǎng)物，也會(huì)導(dǎo)致不同的鑒定結(jié)果；再次，不同研究所采用的抗性鑒定方法及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)也不盡一致；最后，環(huán)境對(duì)白粉病的發(fā)生也有較大的影響。而本研究所采用的煙草品種NC89，是我國(guó)栽培種植面積較大的品種[7]，選其作為親本可使本研究結(jié)果具有較好的代表性。同時(shí)，菌種為純化后的單一菌種，接種及發(fā)病調(diào)查嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，嚴(yán)格控制環(huán)境溫濕度。以上措施有效保證了研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

本研究檢測(cè)到一個(gè)煙草白粉病抗性QTL位點(diǎn)，該位點(diǎn)與SSR標(biāo)記52725緊密連鎖，遺傳距離為1.01 cm，與李華麗等以往的研究相比，在加性效應(yīng)上方向相同，均為負(fù)值，但貢獻(xiàn)率相差較大。據(jù)此可認(rèn)為兩者為不同的QTL位點(diǎn)。由于數(shù)量性狀遺傳在一定程度上受到環(huán)境的影響，因此，檢測(cè)到的QTL數(shù)量及效應(yīng)可能存在不同程度的差異[8-11]，本研究認(rèn)為可以在不同的環(huán)境條件下對(duì)煙草白粉病抗性基因進(jìn)行進(jìn)一步的QTL分析，以期獲得不同環(huán)境條件下的QTLs位點(diǎn)，對(duì)已得到的QTL位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。

煙草白粉病是煙區(qū)廣泛分布的真菌性病害，對(duì)煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為發(fā)掘、鑒定種質(zhì)資源中QTL的等位變異提供了有效的技術(shù)手段，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇培育聚合不同QTL等位變異的高抗品種，將成為白粉病抗病基因資源鑒定與利用的一條新途徑[12]。

4 結(jié)論

本研究利用臺(tái)煙7號(hào)×NC89構(gòu)建的F2群體對(duì)煙草白粉病抗性基因進(jìn)行了QTL分析。檢測(cè)到1個(gè)與煙草白粉病抗性緊密連鎖的QTL位點(diǎn)，該QTL位于52725和54027之間，與52725的遺傳距離僅為1.01cm，其加性效應(yīng)為-14.38，貢獻(xiàn)率為21.02%。

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