楊 越，司軍強，樊 超，馬克濤，成洪聚，李 麗△

（1.新疆民族高發(fā)病教育部重點實驗室，2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，石河子832002；3.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，湖北武漢430071；4.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，新疆石河子832002）

羅哌卡因（ropivacaine）［1］是一種新型的、純左旋體長效酰胺類的局部麻醉藥和鎮(zhèn)痛藥，由于羅哌卡因?qū)\動神經(jīng)的鞘膜、神經(jīng)膜和血腦屏障的穿透能力以及蓄積能力較小，而對C類神經(jīng)纖維（無髓鞘，與痛覺傳導(dǎo)有關(guān)）的阻滯速度快于其對Aδ類纖維（有髓鞘，與運動功能有關(guān)）的阻滯，故認為是羅哌卡因出現(xiàn)感覺與運動神經(jīng)分離［2］阻滯的藥理學(xué)基礎(chǔ)，這對在臨床上用于需要鎮(zhèn)痛而無需運動阻滯是非常理想的選擇。羅哌卡因現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床麻醉和疼痛治療［3］。關(guān)于羅哌卡因的作用機制，迄今為止已提出以下幾個方面：作用于L型Ca2＋通道的二氫吡啶結(jié)合位點［4］；抑制開放性 K＋通道的關(guān)閉［5］；對鈉離子通道的抑制作用［6］等。羅哌卡因藥理作用的發(fā)揮亦可能是多種機制共同作用后的綜合效應(yīng)。γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）是脊髓中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與了疼痛的調(diào)節(jié)。本研究即應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)在新鮮分離的大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元上觀察羅哌卡因?qū)Υ笫驞RG神經(jīng)元GABA激活電流是否存在影響，以探討羅哌卡因產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用可能存在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

羅哌卡因、膠原酶、胰蛋白酶、EGTA、GABA、HEPES均為Sigma公司產(chǎn)品，其余均為國產(chǎn)分析純試劑

1.2 液體配制

玻璃微電極內(nèi)液成分為（mmol／L）：CaCl21；MgCl22；KCl 140；HEPES 10；EGTA 11，電極電阻 3～10MΩ。灌流外液成分為（mmol／L）：NaCl150；CaCl22.5；MgCl21；KCl 5；HEPES 10；D-glucose 10。

1.3 實驗動物

選用由新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供的4～6周齡SD大鼠，體重150～250 g，雌雄不拘，動物質(zhì)量符合一級標準。

1.4 DRG神經(jīng)元急性分離

關(guān)于大鼠DRG神經(jīng)元標本急性分離方法及全細胞膜片鉗記錄技術(shù)詳見文獻［7］。概述如下：取4～6周齡SD大鼠，擊昏、斷頭后迅速取出胸腰段脊柱沿脊柱正中剖成兩半，置pH值為 7.4，滲透壓為340mosm／kg的預(yù)充氧 DMEM液（dubecco’smodified eagle’smedium）內(nèi)。由剖開的椎管內(nèi)側(cè)取出DRG及其相連的前、后神經(jīng)根和脊神經(jīng)，置培養(yǎng)皿中，體視顯微鏡下以精細角膜剪及游絲鑷，仔細剪除與DRG相連的神經(jīng)及結(jié)締組織被膜，剪碎清除干凈的DRG，取膠原酶 1.5 mg／ml，胰蛋白酶 0.6 mg／ml至試管中，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育12 min，間隔4 min吹打30下。孵育畢，加適量大豆胰蛋白酶抑制劑終止酶的消化作用。以1 000 r／min離心6 min，棄上清液，將沉淀物以灌流外液重懸，吹打分散后將DRG神經(jīng)元移至35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)靜置30 min待細胞貼壁后行膜片鉗記錄。

1.4 膜片鉗記錄

全細胞膜片鉗記錄所用儀器為美國Axon 700B放大器。當(dāng)玻璃微電極（美國Sutter公司P-97拉制儀拉制，電極阻抗為3～12 MΩ）與細胞膜間形成高阻（1～8 GΩ）封接后進一步將膜吸破，給予電容和串聯(lián)電阻補償。置保持電壓在-60 mV。膜電流經(jīng)低通濾波（10 Hz，-3 dB）。藥物以外液配制，pH值用NaOH調(diào)到 7.4，滲透壓為 340 mosm／kg，排藥管直徑為0.5mm，管口與所記錄細胞距離100μm，實驗室溫度在（20～28）℃范圍之間進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 Clampfit 10.2（Axon，美國）和 SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示；給藥前后差異采用隨機化配對資料均數(shù)的t檢驗進行分析。

2 結(jié)果

所記錄的DRG神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，部分細胞可連有卷曲的離斷軸突殘端，選取輪廓清晰，折光性好，直徑在15～35μm之間的細胞。

2.1 羅哌卡因?qū)RG神經(jīng)元膜電流的作用

灌流羅哌卡因（0.1～1 000μmol／L）可使大部分（65.7%，48／73）DRG神經(jīng)元產(chǎn)生一幅值在 0～380 pA的具有濃度依賴性的內(nèi)向電流。羅哌卡因介導(dǎo)反應(yīng)的最低濃度為 0.1μmol／L，EC50為 23.46 μmolL，最大反應(yīng)濃度為 1 000μmol／L（圖 1）。

Fig.1 Concentration-dependent depolarization induced by ropivacaine on DRG neurons

2.2 GABA對DRG神經(jīng)元膜電流的影響

實驗共檢測了98個DRG神經(jīng)元，其中74.5%（73／98）對外加 GABA敏感，并能被 GABAA受體特異性拮抗劑荷包牡丹堿（100μmol／L）所阻斷（圖2），濃度為0.1～1 000μmol／L的外加 GABA可引起具有濃度依賴性和明顯去敏感作用的內(nèi)向電流。

2.3 羅哌卡因?qū)ABA激活電流的增強作用

2.3.1 同一濃度羅哌卡因?qū)Σ煌瑵舛菺ABA激活膜電流的增強作用 預(yù)加羅哌卡因（10μmol／L）后GABA激活電流明顯增強，這種增強作用可以被細胞外液洗脫（圖 3A），預(yù)加羅哌卡因（10μmol／L）后GABA激活電流與外加GABA本身激活電流的量效曲線比較，曲線明顯上移（P＜0.05）。其EC50分別為 11.78μmol／L和 15.24μmol／L（n＝18）兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）（圖3B）。灌流羅哌卡因后GABA激活電流的最大值較之對照增強約153%±4.13%（n＝3）。

Fig.2 Effectof bicuculline on the GABAA receptor

Fig.3 Enhancement effectof GABA-activated currents by ropivacaine

2.3.2 羅哌卡因預(yù)灌流不同時間對GABA激活電流增強作用的影響 實驗中我們觀察了羅哌卡因預(yù)灌流時間對其增強GABA激活電流作用的影響，分別選取 0（即不作預(yù)灌流）、10、20、30、40 s等多個時間點進行觀察。發(fā)現(xiàn)羅哌卡因（10μmol／L）對GABA（100μmol／L）激活電流的增強作用隨預(yù)灌流時間的延長而增加，分別增強了 17.1%±3.5%、31.1%±6.6%、46.9% ±15.2%、89.1% ±2%、73.2% ±19.3%（各時間點n＝3）。在大約30 s之后羅哌卡因?qū)ABA電流的增強作用隨預(yù)灌流時間延長而增強的幅度有所下降，故認為在預(yù)灌流羅哌卡因30秒時其增強作用最顯著（n＝3），各時間點增強率比較，差異極顯著（P＜0.01，圖 4）。

2.3.3 不同濃度羅哌卡因?qū)ν粷舛菺ABA激活電話的增強作用 預(yù)灌流羅哌卡因（0.1～1 000 μmol／L）30 s后給予外加100μmol／LGABA能顯著增強 GABA（100μmol／L）激活電流的幅值。

Fig.4 Relationship between the time of pre-perfusion ripivacaine and the enhancementof EGABA currents

Fig.5 Enhancement effect of giving 100μmol／L GABA by preperfusion with different concentrations of ropivacaine（0.1～1 000μmol／L）

3 討論

本研究在大鼠DRG神經(jīng)元上觀察到羅哌卡因自身所引起的具有濃度依賴性的膜電流。其產(chǎn)生原因可能與羅哌卡因引起神經(jīng)元膜上某種離子通道開放，造成陰離子外流或陽離子內(nèi)流等有關(guān)。由于此種電流幅值比較?。ǎ?80 pA），且不穩(wěn)定，因而本文未就其具體機制作深入探討。DRG神經(jīng)元上GABA引起具有濃度依賴性和明顯去敏感作用的內(nèi)向電流，此電流可以被GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿所阻斷［8］，不同濃度的羅哌卡因?qū)GABA均表現(xiàn)為明顯的增強作用，表明羅哌卡因發(fā)揮其增強IGABA作用的作用位點可能在GABAA受體上。GABAA受體作為氯離子（Cl-）通道的門控受體，不僅有GABA結(jié)合位點還有變構(gòu)劑結(jié)合位點，羅哌卡因使Cl-內(nèi)流增加，提示羅哌卡因可能與GABA位點特異性結(jié)合直接或間接易化了GABA受體活性，或者參與了GABAA受體的變構(gòu)從而增強了GABA作用于受體的效能。由圖4可以看到，隨著預(yù)灌流羅哌卡因的時程增長，其對GABA激活電流的增強作用也加大，但是灌流40 s甚至更長時間后羅哌卡因的這種增強作用有所減弱，其最大效應(yīng)的發(fā)揮出現(xiàn)在灌流時間30 s時。如圖5所示的，灌流羅哌卡因在高濃度（1 000μmol／L）時其增強GABA激活膜電流的作用強度出現(xiàn)下降，但仍表現(xiàn)為明顯的增強作用，故認為其最大效應(yīng)的發(fā)揮大概出現(xiàn)在100μmol／L濃度時。

GABA作為脊髓中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其突觸前抑制作用的發(fā)揮大部分是由GABAA受體介導(dǎo)的，杜冬萍［9］曾在急性新鮮分離的大鼠海馬錐體神經(jīng)元觀察羅哌卡因?qū)ABAA介導(dǎo)氯電流的影響，以探討局麻藥中樞毒性反應(yīng)的可能機制，其觀察到不同濃度的利多卡因、羅哌卡因、布比卡因?qū)GABA都有明顯的抑制作用，由此認為這種抑制作用可能是局麻藥中樞致驚厥的產(chǎn)生機制。而本文在大鼠DRG神經(jīng)元上的實驗結(jié)果證實，羅哌卡因?qū)ABAA受體功能具有增強作用，GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其突觸前抑制作用被增強，從而可使羅哌卡因表現(xiàn)出更明顯的鎮(zhèn)痛作用，由此可見羅哌卡因?qū)Τ跫墏魅胪挥|前抑制存在作用，說明羅哌卡因產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用可能是在外周神經(jīng)元通過增強GABA受體作用而發(fā)揮的。

總之，羅哌卡因增強GABAA受體介導(dǎo)的突觸前抑制作用可能是其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的機制之一。其具體機理可能是：1.羅哌卡因通過結(jié)合GABA位點或者參與GABAA受體的變構(gòu)增加Cl-通道開放頻率和開放時間從而增加Cl-流量；2.直接激活 Cl-通道引起Cl-內(nèi)流，從而增強GABAA受體介導(dǎo)的突觸前抑制效應(yīng)，使初級感覺信息（尤其是痛覺）傳入神經(jīng)末梢的動作電位減小，進而引起相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)末梢的釋放減少，造成脊髓背角的痛敏神經(jīng)元活動減少從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

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