孫彩云，李美婷，李虹姣，王嘵嘵

（河北聯(lián)合大學 輕工學院，河北 唐山 063000）

堿-乙醇法提取蠶沙中黃酮的工藝研究

孫彩云，李美婷，李虹姣，王嘵嘵

（河北聯(lián)合大學 輕工學院，河北 唐山 063000）

以蘆丁的提取率為指標，考察了提取時間、提取溫度、堿度、乙醇濃度對蠶沙中黃酮提取率的影響，并通過單因素及正交試驗確定最佳工藝。結(jié)果表明，堿度、乙醇濃度、提取時間、提取溫度對蠶沙中總黃酮的提取均有影響；最佳提取工藝為NaOH濃度為3%，乙醇濃度15%，提取時間1.5 h，提取溫度70 ℃，蠶沙中黃酮含量約為1.65%。

蠶沙；黃酮；正交試驗；提取

黃酮類化合物泛指兩個苯環(huán)通過中央三碳相互聯(lián)接而成的一系列化合物，即以C6-C3-C6為基本碳架，是一類在植物界廣泛存在的天然活性產(chǎn)物，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗衰老等多種生物功能[1]。黃酮類化合物因分子中有酚羥基而呈酸性，故可溶于堿性溶液；其羥基糖苷化后一般易溶于熱水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑[3]。蠶沙性甘、辛、溫，自古入藥。蠶沙中含有豐富的黃酮、葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、果膠及糖類等多種成分，提取蠶沙中黃酮多以水或稀乙醇為提取劑[1,2]。為有效利用蠶沙中的黃酮，本文采用堿-乙醇做提取劑，對其提取工藝進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

蠶沙（購買，研細過40目篩備用）；蘆丁標準溶液（200 μg·mL-1）：精確稱取20 mg蘆丁，用60%乙醇溶液微熱溶解，并完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以60%乙醇溶液稀釋至刻度，4°C以下冰箱內(nèi)保存；乙醇溶液；1 mol·L-1NaOH溶液；10% Al(NO3)3溶液；5% NaNO2溶液。

1.1.2 儀器

722E型分光光度計（上海光譜儀器有限責任公司）；HH-8型恒溫數(shù)顯水浴鍋（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）；BS124S型電子天平（賽多利斯儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 黃酮的提取

稱取2 g蠶沙，以堿-乙醇做提取劑，料液比1:10，提取2 h后過濾，定容至100 mL容量瓶中?？傸S酮的提取率以吸取一定量的提取液經(jīng)顯色后的吸光度來表征。

1.2.2 總黃酮的定量方法

以蘆丁為對照標準品（蘆丁為黃酮苷，是較常見的黃酮類化合物，具有C6-C3-C6的基本碳架結(jié)構(gòu)），采用NaNO2-Al(NO3)3比色法定量總黃酮。

1.2.2.1 吸收曲線的繪制

準確吸取1 mL蘆丁標準溶液于25 mL具塞比色管中，用NaNO2-Al(NO3)3比色法顯色后，用1 cm比色皿，以空白試劑作為參比，在480 nm～530 nm范圍掃描，分別測定其A值，繪制吸收曲線，確定最大吸收波長。

1.2.2.2 標準曲線的繪制

準確吸取一定量（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL）蘆丁標準溶液于25 mL具塞比色管中，用30%乙醇稀釋至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后加入1 mol·L-1NaOH溶液4 mL，加30%乙醇溶液0.4 mL，搖勻，10 min之后，在最大吸收波長處，用1 cm比色皿，以試劑空白為參比，測定吸光度A值，并繪制標準曲線。

1.2.3 單因素實驗

固定其他條件不變，分別考察乙醇濃度、NaOH濃度、提取溫度、提取時間對提取效果的影響。

1.2.4 正交實驗

因素水平表見表1，采用L9(34)正交表設(shè)計實驗。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長及標準曲線

圖1為蘆丁-NaNO2-Al(NO3)3顯色后的吸收曲線。

圖1 蘆丁-NaNO2-Al(NO3)3顯色后吸收曲線

由圖1可見，蘆丁顯色后最大吸收波長在510 nm附近。圖2為在510 nm處繪制的A-C標準曲線。

由圖2可得標準曲線的回歸方程為：

在0～70μg/mL內(nèi)線性良好。

圖2 蘆丁標準曲線

2.2 乙醇濃度對黃酮提取效果的影響

固定提取溫度、提取時間、料液比、NaOH濃度等條件不變，考察乙醇濃度對提取效果的影響，結(jié)果見圖3。

老人對呼倫說，我還以為這本書你用不著了。呼倫說那您也不能隨便往外借家里的東西啊！老人說可是他參觀完你的書房以后硬要借走這本書……說他家里也有幾枚老古錢，想對著書看一下能不能挑出幾個值錢的。呼倫說您還帶別人參觀書房？老人撓撓頭皮說，不可以嗎？呼倫嘆一口氣，說，那這樣吧，明天您再幫我把書要回來……不是我想難為您，媽，如果是別的書也就罷了，可是我還得靠這本書寫我的稿子呢。老人想了想，說，可是我不知道他叫什么。

圖3 乙醇濃度對提取液吸光度值的影響

由圖3可知，隨著乙醇濃度逐漸增大，蠶沙總黃酮的提取率逐漸減小，表明蠶沙含有的黃酮結(jié)構(gòu)中極性基團較多，為多羥基黃酮，黃酮結(jié)構(gòu)上的羥基顯弱酸性[3]，易溶于極性大的溶液中，但乙醇濃度太低，水溶性雜質(zhì)會增多。

2.3 NaOH濃度對黃酮提取效果的影響

固定乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比等條件不變，考察NaOH濃度對提取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 NaOH濃度對提取液吸光度值的影響

由圖4可知，隨著加入的NaOH濃度逐漸增大，吸光度值逐漸增加，在2%～5%范圍吸光度A比較穩(wěn)定，在6%以上吸光度顯著增大，可能是破壞了黃酮的結(jié)構(gòu)。而小于2%的濃度時，A值顯著降低，所以確定適宜的堿度范圍為2%～5%。

2.4 不同濃度的NaOH-乙醇液對黃酮提取的影響

固定提取溫度、提取時間、料液比等條件不變，考察不同濃度堿-乙醇溶液對黃酮提取效果的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度的堿-乙醇溶液對吸光度的影響

由表2可知，采用3%NaOH-15%乙醇做提取劑，提取液的A值最大。

固定乙醇濃度、提取時間、料液比、NaOH濃度等條件不變，考察溫度對黃酮提取效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對吸光度值的影響

由圖5可見，隨著提取溫度的升高，A值增加，在70℃時最大，80 ℃以后A值略有下降，原因可能是溫度超過80 ℃后，由于高于乙醇的沸點，使得溶劑少量揮發(fā)；另外，溫度太高，堿-乙醇溶劑也可能會破壞提取物的結(jié)構(gòu)，故確定適宜的提取溫度為70 ℃。

2.6 提取時間對黃酮提取效果的影響

固定堿-乙醇溶液濃度、提取溫度、料液比等條件不變，考察不同提取時間對黃酮提取效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 提取時間對吸光度值的影響

由圖6可見，隨著提取時間的增加，A值增加，1.5 h后A值較高且趨于穩(wěn)定，2.5 h后A值稍有所下降，故確定適宜的提取時間為1.5～2 h。

2.7 正交試驗

表3 正交試驗結(jié)果

由表3正交試驗極差分析顯示，影響測定蘆丁標準溶液的因素主次順序為：提取時間>乙醇濃度>提取溫度>NaOH濃度，最佳條件為：3%NaOH，15%乙醇，提取時間1.5 h，提取溫度70 ℃。和單因素實驗結(jié)果一致。

2.8 驗證試驗

在正交試驗確定的最佳條件下提取兩次，合并濾液，并在相同條件下顯色，測定其吸光度為0.936，然后根據(jù)蘆丁標準曲線即可求得蠶沙中黃酮的含量約為1.65%。

3 結(jié)論

（1）采用NaNO2-Al(NO3)3法測定蠶沙提取液中蘆丁含量，λmax=510 nm，線性回歸方程為A=0.011 4C+0.001 8，r=0.999 8，0～70μg/mL線性良好。

（2）采用堿-稀醇作溶劑從蠶沙中提取黃酮，通過單因素實驗和正交試驗得出了從蠶沙中提取黃酮的最佳提取條件為：3%NaOH，15%乙醇，提取時間1.5 h，提取溫度70 ℃。在此條件下進行了驗證實驗，蠶沙中黃酮的總含量約為1.65%。

[1] 于善凱,沈鳳鳴.蠶沙葉綠素提取廢渣中黃酮類化合物的提取工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā),2007,28(5):46-48. [2] 李巖亮.蠶沙中黃酮類化合物提取及純化的研究[J].遼寧絲綢,2006(2):10-12.

[3] 徐任生.天然產(chǎn)物化學[M].北京:科學出版社,2005.

（責任編輯、校對：琚行松）

Extraction of Flavonoids in Silkworm Excrement by Alkali-Ethanol

SUN Cai-yun, LI Mei-ting, LI Hong-jiao, WANG Gai-gai

(College of Light Industry, Hebei United University, Tangshan 063000, China)

The effects of extinction time and temperature, alkalinity, ethanol concentration on the extraction rate of flavones were investigated with Rutosids. The optimum extraction condition of flavone from Silkworm excrement was determined by single factor experiment and orthogonal experiment. The extinction time, temperature, alkalinity, and level of alcohol all affect the extraction of flavone from Silkworm excrement. The best extraction technological conditions was as follows: the extraction time was 1.5 h, the extraction temperature was 70°C, NaOH concentration was 3%, ethanol concentration was 15%, and thus the extraction yield of total flavone was 1.65%.

silkworm excrement; flavonoids; orthogonal experiment; extraction

TQ041

A

1009-9115(2013)02-0007-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2013.02.003

2012-12-25

孫彩云（1972-），女，河北遵化人，碩士，講師，研究方向為天然物質(zhì)提取。