木瀠，朱茂祥，潘秀頡，楊陟華，齊紹武

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草工程技術(shù)研究中心，長沙410128；2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

近年來，卷煙安全性問題受到日益顯著的重視。卷煙煙氣是由數(shù)千種化合物組成的一種混合物[1]。卷煙煙氣具細(xì)胞毒性、遺傳毒性及誘變性，這些化合物之間的相互作用會(huì)影響單一物質(zhì)對(duì)卷煙煙氣毒性的貢獻(xiàn)。謝劍平等[2]研究發(fā)現(xiàn)：在卷煙煙氣眾多有害成分中，對(duì)卷煙主流煙氣危害性影響最大的7項(xiàng)有害成分指標(biāo)為∶ CO、HCN、NH3、甲基亞硝胺吡啶基丁酮（NNK）、苯并[a]芘（B[a]P）、苯酚、巴豆醛。當(dāng)前常規(guī)卷煙安全性評(píng)價(jià)的方法最常用的是對(duì)焦油、一氧化碳和煙氣煙堿三項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)[3],很少涉及到卷煙煙氣有害物之間的相互作用關(guān)系、煙氣吸入后對(duì)人體的毒性作用及其作用機(jī)制等問題的研究, 這顯然是不全面的。相關(guān)研究表明[4-9]，卷煙煙氣和煙氣冷凝物均可以導(dǎo)致細(xì)胞微核的出現(xiàn)。卷煙煙氣冷凝物可以導(dǎo)致培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞出現(xiàn)染色體畸變[10-14]。微核試驗(yàn)作為推斷化合物染色體損傷的遺傳毒性檢測(cè)方法，具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，在環(huán)境化合物快速篩選和大量職業(yè)暴露人群檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用。微核檢測(cè)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性優(yōu)于其它染色體畸變分析，因此許多國家和國際組織將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的必做實(shí)驗(yàn)[15]。微核檢測(cè)方法主要集中于鏡檢法（常規(guī)微核試驗(yàn)、胞質(zhì)分裂阻滯法、熒光原位雜交試驗(yàn)與DNA 探針、抗著絲?？贵w染色）和自動(dòng)化法（圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)）[16]。

B[a]P、NNK為兩種卷煙煙氣重要代表有害物，具一定的致癌性[17-18]，已成為近年來有關(guān)煙草致癌研究的熱點(diǎn)，卷煙主流煙氣化學(xué)成分中B[a]P、NNK的含量情況如下表1所示[2]。筆者以肯塔基參比卷煙3R4F為研究對(duì)象，以B[a]P、NNK為目標(biāo)化合物，采用廣泛應(yīng)用于細(xì)胞誘變性試驗(yàn)的鏡檢微核法[19]，結(jié)合三者對(duì)人體支氣管上皮細(xì)胞的毒性作用，分析B[a]P、NNK在卷煙煙氣復(fù)雜基質(zhì)中的聯(lián)合作用，以期為卷煙煙氣的安全性評(píng)價(jià)提供參考。

表1 163種不同類型卷煙樣品中NNK和B[a]P成分比較[2]

1 材料與方法

1.1 材料

肯塔基參比卷煙3R4F(美國肯塔基大學(xué))；LHC-8培養(yǎng)液( Biofluids Inc公司)；胰蛋白酶、B[a]P (純度≥96%，Sigma公司)；NNK (純度≥99.0%，Alfar Aesar公司)；細(xì)胞松弛素B(Applichem公司)；DAPI(羅氏試劑)；甲醇溶液；潔凈工作臺(tái)(北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司)；TS100倒置顯微鏡(Nikon公司 )；BB15型 CO2孵 箱 (Thermo公 司 )；Milli-Q50超純水儀(Millipore公司)；JJ100型單通道吸煙機(jī)（中國煙草總公司鄭州煙草研究院）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B），用無血清的LHC-8培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2和95%濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[19]。

1.3 卷煙煙氣凝聚物（CSC）的制備

設(shè)定抽煙機(jī)抽吸周期為 60 s、抽吸長度為 2 s，抽吸容量為 30 mL。連接密封的兩個(gè)玻璃氣體采樣收集器，第一個(gè)收集器內(nèi)裝有 5.0 mL 95%的乙醇，另一個(gè)收集器內(nèi)裝有 5.0 mL 雙蒸水，用打火機(jī)點(diǎn)燃卷煙樣品，將燃燒產(chǎn)生的煙氣通過橡皮導(dǎo)管通入氣體收集管，依照早已設(shè)定的抽吸速率，連續(xù)不停地收集10 支卷煙抽吸產(chǎn)生的煙氣于收集器內(nèi)。等最后一支抽吸完后，將兩個(gè)收集器中的液體充分混勻，定容至10.0 mL 容量瓶中搖勻，分裝在 0.5 mL EP管中用封口膜封口，后放入液氮罐中儲(chǔ)藏備用。卷煙煙氣冷凝物CSC的濃度為10mg/mL[20]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 微核試驗(yàn)方法

筆者先采用細(xì)胞毒性測(cè)試檢測(cè)出三種受試物的IC50[20]。收集處于指數(shù)生長期的BEAS-2B細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（1.4×105個(gè)/mL），接種于35×10mm小皿（2mL/皿），在相對(duì)濕度95%、5%CO2、37℃下培養(yǎng)24 h后按劑量染毒，設(shè)置空白對(duì)照組、處理組（1/10 IC50、1/5 IC50、IC50三個(gè)濃度）、陽性對(duì)照組，每組設(shè)三個(gè)平行試驗(yàn)。取一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)液（內(nèi)含2.8×105個(gè)細(xì)胞），于離心涂片機(jī)（500rpm，5min，低加速度）進(jìn)行涂片，將上述玻片浸入100%甲醇（10min），于黑暗環(huán)境中放置直至染色，固定后的玻片浸入DAPI液（10min），然后于400X熒光顯微鏡下進(jìn)行微核計(jì)數(shù)。每一組培養(yǎng)液分析2000個(gè)單核細(xì)胞（非凋亡或死亡）的細(xì)胞微核數(shù)，每組培養(yǎng)液重復(fù)兩次（等于4000個(gè)細(xì)胞）計(jì)算微核率。（微核觀察需注意一下條件：微核為近圓形，同細(xì)胞主核染色近乎相同，Size≤1/3細(xì)胞主核，微核與主核接觸但并不與之重疊）[21]。

1.4.2 聯(lián)合作用細(xì)胞毒性的測(cè)定與分析

采用線性回歸分析CSC、B[a]P、NNK三者之間的聯(lián)合作用。即計(jì)算出三種受試物（三個(gè)劑量）分別誘發(fā)細(xì)胞微核率后，選擇各個(gè)受試物低劑量（1/10IC50），再與另外兩種受試物混合后作用BEAS-2B細(xì)胞。根據(jù)聯(lián)合染毒誘發(fā)的細(xì)胞微核率，計(jì)算出CSC、B[a]P、NNK兩兩作用和三者聯(lián)合作用的預(yù)期值[22]，并與實(shí)際值相比較。實(shí)際值小于預(yù)期值，表明受試物之間為協(xié)同作用；實(shí)際值大于預(yù)期值，表明受試物之間為拮抗作用；實(shí)際值與預(yù)期值接近，表明受試物之間無明顯協(xié)同作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單獨(dú)作用遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知， CSC、NNK和B[a]P均可誘發(fā)細(xì)胞微核率增高，并有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。相同細(xì)胞存活劑量條件下，誘發(fā)細(xì)胞微核形成能力比較：B[a]P＞NNK＞CSC。

表2 CSC、NNK、B[a]P單獨(dú)作用誘發(fā)BEAS-2B細(xì)胞微核率

2.2 聯(lián)合作用遺傳毒性

2.2.1 B[a]P與CSC聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核率

由圖1可知，固定低劑量B[a]P（1/10 IC50）與不同濃度CSC聯(lián)合作用，固定低劑量CSC（1/10 IC50）與不同濃度B[a]P聯(lián)合作用，隨著劑量的增加，細(xì)胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)。誘發(fā)細(xì)胞微核率均顯著低于預(yù)期值，并與作用的先后順序無關(guān)，特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng)，提示兩者聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。誘發(fā)細(xì)胞微核能力比較∶ B[a]P+CSC ＞ CSC+ B[a]P。

2.2.2 CSC與NNK聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核率

由圖2可知，固定低劑量CSC（1/10 IC50）與不同濃度NNK聯(lián)合作用，固定低劑量NNK（1/10IC50）與不同濃度CSC聯(lián)合作用，隨著劑量的增加，細(xì)胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)。誘發(fā)細(xì)胞微核率明顯低于預(yù)期值，并與作用的先后順序無關(guān)，特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng)，提示兩者聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。誘發(fā)細(xì)胞微核能力比較∶NNK+CSC ＞ CSC+NNK。

圖1 B[a]P與CSC聯(lián)合作用對(duì)BEAS-2B細(xì)胞微核率的影響

圖2 CSC與NNK聯(lián)合作用對(duì)BEAS-2B細(xì)胞微核率的影響

2.2.3 B[a]P與NNK聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核率

由圖3可知，固定低劑量B[a]P（1/10 IC50）與不同濃度NNK聯(lián)合作用，固定低劑量NNK（1/10 IC50）與不同濃度B[a]P聯(lián)合作用，隨著劑量的增加，細(xì)胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)。誘發(fā)細(xì)胞微核率顯著低于預(yù)期值，特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng)，提示兩者聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。誘發(fā)細(xì)胞微核能力比較∶NNK+B[a]P ＞ B[a]P+ NNK。

圖3 B[a]P與NNK聯(lián)合作用對(duì)BEAS-2B細(xì)胞微核率的影響

2.2.4 CSC、B[a]P與NNK三者聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核率

由圖4可知，三者聯(lián)合作用隨著劑量的增加，細(xì)胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)。誘發(fā)細(xì)胞微核率顯著低于理論預(yù)期值2，但與理論預(yù)期值1的結(jié)果相差較小。特別是固定低劑量B[a]P（1/10 IC50）和固定低劑量NNK（1/10 IC50）存在時(shí)，再加入CSC誘發(fā)的細(xì)胞微核率接近理論預(yù)期值1，提示有較弱的相互作用（弱相加）。誘發(fā)細(xì)胞微核能力 比 較 ∶ (B[a]P+NNK)+CSC ＞ (CSC+B[a]P)+NNK ＞(NNK+CSC)+B[a]P。

圖4 CSC、B[a]P與NNK三者聯(lián)合作用對(duì)BEAS-2B細(xì)胞微核率的影響

3 討論

相關(guān)研究[23-24]表明，支氣管上皮細(xì)胞為吸入式有害物質(zhì)在體內(nèi)代謝活化的主要場所。本實(shí)驗(yàn)所用BEAS-2B細(xì)胞，是由正常人支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)腺病毒-12/SV40雜交病毒感染，連續(xù)傳代篩選而永生化所得，是研究肺癌相關(guān)機(jī)理的重要靶細(xì)胞。B[a]P可導(dǎo)致肺癌A549細(xì)胞DNA損傷，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯[25]；B[a]P與多氯聯(lián)苯聯(lián)合作用時(shí)，能抑制B[a]P代謝產(chǎn)物葡萄糖化，減緩B[a]P代謝速率[26]；2, 4,6 - 三硝基甲苯(TNT)與B[a]P呈拮抗效應(yīng)，可阻止B[a]P進(jìn)入細(xì)胞[27]。NNK在煙草中含量高，能造成細(xì)胞的氧化損傷[28]，誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[29], 與肺癌的相關(guān)性很高[30]。α粒子和NNK聯(lián)合作用于BEP-2D細(xì)胞時(shí)，協(xié)同效應(yīng)顯著[31]，而B[a]P和NNK之間的聯(lián)合作用卻少見文獻(xiàn)報(bào)道。探究B[a]P、NNK在卷煙煙氣復(fù)雜基質(zhì)中的相互作用關(guān)系，有利于分析卷煙煙氣有害物質(zhì)的毒性作用及相關(guān)機(jī)理，構(gòu)建符合其特征性的危害性研究方法。

本試驗(yàn)以BEAS-2B為靶細(xì)胞，通過對(duì)CSC及其最具代表性的有害成分NNK和B[a]P的聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核能力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)B[a]P、NNK與CSC均具有體外細(xì)胞誘變性，且存在明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。B[a]P與CSC的聯(lián)合作用、B[a]P與NNK的聯(lián)合作用、CSC與NNK的聯(lián)合作用均具有劑量依賴效應(yīng)，但比預(yù)期毒性小，并與作用的先后順序無關(guān)。特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng)，提示兩兩聯(lián)合作用誘發(fā)細(xì)胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。三者聯(lián)合作用時(shí)均具明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，誘發(fā)細(xì)胞微核率顯著低于理論預(yù)期值2，但與理論預(yù)期值1的結(jié)果相差較小。特別是固定低劑量B[a]P（1/10 IC50）和固定低劑量NNK（1/10 IC50）存在時(shí)，再加入CSC誘發(fā)的細(xì)胞微核率接近理論預(yù)期值1，提示有較弱的相互作用（弱相加）。筆者推測(cè)B[a]P和NNK可能與卷煙煙氣中其他成分發(fā)生協(xié)同作用作用，隨著CSC含量的上升，激活了BEAS-2B細(xì)胞CSC中其他物質(zhì)代謝的相關(guān)酶類物質(zhì)，促使CSC代謝加快，表現(xiàn)為誘發(fā)微核率上升趨勢(shì)較快，增大了細(xì)胞的遺傳毒性。

4 小結(jié)

本研究證實(shí)B[a]P、NNK與CSC之間兩兩聯(lián)合存在拮抗作用，而三者之間的聯(lián)合作用呈現(xiàn)協(xié)同（弱相加）效應(yīng)。這一結(jié)果，對(duì)評(píng)價(jià)卷煙煙氣中有害成分的危害性具有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí)也提示卷煙煙氣中其他有害成分（如苯酚、巴豆醛、重金屬等）物質(zhì)之間的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

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