陳德鑫，許家來，馬志遠(yuǎn)，郭志剛，安德榮

1中國(guó)煙草總公司青州煙草研究所，山東省青島嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；2 山東煙草研究院， 山東省濟(jì)南市新濼大街中段南側(cè) 250101；3西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 陜西省楊凌示范區(qū)邰城路3號(hào) 712100；4陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，陜西省寶雞市寶煙路1號(hào) 720001

煙堿占煙草生物堿的95%以上[1-3],煙葉中煙堿的含量與自然條件、農(nóng)業(yè)技術(shù)措施、煙草類型、調(diào)制方法等因素有關(guān)。近幾年，利用微生物及其酶降解煙草中的煙堿含量,已成為一種既可降低煙堿含量又能改進(jìn)卷煙品質(zhì)的理想方法。目前研究表明,自然界特別是在優(yōu)質(zhì)煙葉表面存在多種能有效降解煙堿的微生物,如假單胞桿菌(Pseudomonasputid)、嗜煙堿節(jié)桿菌(Arthrobacter nicoti-novorans)、氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)等菌種[6-16]。

本研究從卷煙廠提供的國(guó)內(nèi)外30余種醇化煙葉樣品表面分離得到了10株降低煙堿含量細(xì)菌,進(jìn)一步篩選出一株具有降解高濃度煙堿的降解菌,并研究了不同煙堿濃度下該菌株的降解能力和其在降低煙堿含量發(fā)酵試驗(yàn)中的降解能力。旨在為降低煙葉煙堿含量、提高煙葉可用性等方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙葉樣品：云南昆明07C2F、陜西商洛07B4F-H2、貴州遵義08C3F、湖北十堰B2F、津巴布韋01C07等，均由陜西中煙公司提供。

煙堿（濃度≥98%）：C10H14N2由陜西天則生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 17.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

富集培養(yǎng)基：K2HPO413 g，(NH4)SO41 g，KH2PO44 g，酵母粉1 g和煙堿 1 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO413 g，(NH4)SO41 g，KH2PO44 g，酵母粉 1 g和煙堿 1 g，微量元素溶液10 mL，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0。

微量元素：MgSO41 g，MnSO40.4 g，CaCl20.2g，F(xiàn)eSO40.2 g，用0.1 mol/L HCl定容至100 mL。

1.2 降低煙堿含量細(xì)菌的分離與篩選

1.2.1 降低煙堿含量細(xì)菌的初步分離

將5 g煙葉樣品加入到含有100 mL液體富集培養(yǎng)基中，30 ℃和220 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48 h，然后取100 μL上清液，加入900 μL無菌水，搖勻，即得10-1倍的菌液；再取100 μL 10-1倍的菌液，加900 μL無菌水，搖勻得10-2倍的菌液，稀釋至10-8倍。吸取20 μL 10-7和10-8倍菌液，分別涂布于分離培養(yǎng)基平板，在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h 挑選單菌落進(jìn)一步劃線分離，重復(fù)操作，直到獲得純化菌株。

1.2.2 降低煙堿含量細(xì)菌的復(fù)篩

將得到的細(xì)菌分別接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃和220 r/min下?lián)u床培養(yǎng)48 h,取出，采用紫外分光光度法測(cè)定煙堿含量。根據(jù)培養(yǎng)基中煙堿降低量的多少來復(fù)選優(yōu)良菌株。

1.2.3 發(fā)酵液中煙堿的測(cè)定

以0.05 mol/L HCl為參比液,檢測(cè)發(fā)酵液在236 nm,259 nm, 282 nm 處的吸光值,吸光值A(chǔ)為∶

對(duì)照煙堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)，計(jì)算發(fā)酵液中煙堿的含量。

煙堿降解率公式為：

1.2.4 高效降低煙堿含量細(xì)菌的鑒定

在平板上觀察菌落形態(tài)，并在電鏡下觀察菌株形態(tài)，進(jìn)行生理生化和16SrDNA的鑒定。

1.3 降低煙堿含量細(xì)菌的功能研究

1.3.1 降低煙堿含量細(xì)菌菌劑的制備

將高效降解煙堿的菌株接種于100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，得到種子液。將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接到1L的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液以4000 r/min離心10 min，用無菌水洗滌沉淀，最后用20 mL無菌水振蕩均勻，使用時(shí)稀釋10倍得到菌劑。

1.3.2 煙絲發(fā)酵

將供試煙絲50 g噴施菌劑10 mL，對(duì)照噴施等量無菌水。3次重復(fù)。然后將處理后的煙絲樣品放入25 ℃，60%的恒溫恒濕箱內(nèi)發(fā)酵5 d，用于化學(xué)成分的測(cè)定。

1.3.3 煙樣化學(xué)成分測(cè)定

將處理后的煙樣送到陜西中煙工業(yè)公司技術(shù)中心進(jìn)行化學(xué)成分檢測(cè)。

1.3.4 感官評(píng)吸

將處理組和對(duì)照組的煙絲放入恒溫恒濕箱中平衡24 h后，制成卷煙，樣品和對(duì)照均隨機(jī)編號(hào)。由評(píng)吸專家評(píng)吸。

2 結(jié)果與分析

2.1 降低煙堿含量細(xì)菌的篩選

經(jīng)富集分離，篩選出10株降解煙堿效果較好的細(xì)菌。觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如表1所示。

表1 10株降低煙堿含量細(xì)菌的菌落形態(tài)

接種不同細(xì)菌后的液體培養(yǎng)基中的煙堿含量出現(xiàn)不同程度的變化，經(jīng)過分析得到降解率，如表2。

表2 液體培養(yǎng)基中不同細(xì)菌對(duì)煙堿的降解率

對(duì)煙堿降解效果最好的菌株MK21進(jìn)行煙堿初始濃度2 mL/L的液體培養(yǎng)基發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)其煙堿含量變化進(jìn)行分析：發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，發(fā)酵液中的煙堿含量在下降，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到46 h后，煙堿含量降低率超過了90%。結(jié)果如圖1。

圖1 MK21降低煙堿含量發(fā)酵試驗(yàn)

2.2 高效降低煙堿含量菌劑噴施煙絲的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過降低煙堿含量菌劑處理的各類煙樣的化學(xué)成分發(fā)生了明顯變化，總糖、還原糖和鉀含量有所增加，煙堿和氯的含量明顯降低，如表3。

表3 菌劑對(duì)煙樣化學(xué)成分含量的影響

（續(xù)表3）

2.3 煙樣的感官評(píng)吸

將菌劑MK21的處理組和對(duì)照組的煙樣制成卷煙，供卷煙專業(yè)評(píng)吸人員進(jìn)行評(píng)吸。評(píng)吸結(jié)果表明經(jīng)過菌劑MK21處理的煙樣，具有明顯提高香氣，降低刺激性、掩蓋雜氣和改善口感的效果。如表4。

表4 菌劑對(duì)感官評(píng)吸的影響

2.4 高效降低煙堿含量菌株MK21的鑒定

2.4.1 生理生化特性

通過群體菌落觀察，該菌落特征均為不規(guī)則型，邊緣不整齊透明，為淡灰色，在液體中無菌膜，菌株渾濁、無沉淀。降低煙堿含量細(xì)菌MK21生理生化特性鑒定結(jié)果見表5。

表5 菌株MK21的生理生化特征

將以上試驗(yàn)結(jié)果與《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》上有關(guān)細(xì)菌的描述比較，結(jié)果表明菌株MK21的生理生化特性與短芽孢桿菌屬（Brevibacilles Shida）的特性基本一致，因此，降低煙堿含量細(xì)菌MK21初步鑒定結(jié)果為短芽孢桿菌屬。

2.4.2 16S rDNA鑒定

圖2 透射電鏡和掃描電鏡下MK21菌落形態(tài)

利用Blast在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，菌株MK21的16S rDNA序列與短短芽孢桿菌具有較高的同源性（＞99.7%），并結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，可確定該降低煙堿含量細(xì)菌為短小芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

本研究通過選用特殊的選擇性培養(yǎng)基，即煙堿作為微生物生長(zhǎng)所需的唯一的碳源和氮源，從醇化煙葉表面分離篩選到一株高效降解煙堿的細(xì)菌，經(jīng)過初步鑒定為短小芽孢桿菌，命名為BrevibacillesShida MK21。將菌株制成菌劑后結(jié)合生物降解試驗(yàn)，處理后的煙樣煙堿、氯含量較對(duì)照煙樣有所降低，且處理后的煙葉香氣質(zhì)改善，香氣量增加，煙葉內(nèi)固有的刺激性和雜氣都有所降低。因此，噴施菌劑MK21對(duì)煙葉的品質(zhì)有明顯的改善。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的有降解煙堿功效的微生物主要有：惡臭假單胞菌（Pseudananas putida）、氧化節(jié)桿菌（Arthrobacter axidans）、纖維單胞菌（Cellulanonas sp）、嗜煙堿節(jié)桿菌(Arthrobacter nicoti-novorans)等，而本研究中獲得的MK21尚未在國(guó)內(nèi)外報(bào)道中出現(xiàn)類似降解煙堿的微生物。

在煙葉發(fā)酵過程中，微生物發(fā)揮著重要的作用。目前的研究表明，在煙葉發(fā)酵過程中，微生物的生長(zhǎng)代謝所產(chǎn)生的許多次生代謝產(chǎn)物對(duì)煙葉的化學(xué)成分的變化起著催化作用，促進(jìn)大分子化合物轉(zhuǎn)化和增香物質(zhì)的產(chǎn)生[17-20]。本實(shí)驗(yàn)中的短小芽孢桿菌MK21對(duì)煙葉中的煙堿有明顯的降低作用，但其在發(fā)酵過程中是否會(huì)增加煙葉中的增香物質(zhì)需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。與此同時(shí)，微生物降解煙堿提高香氣，改善煙葉品質(zhì)是多種因素共同作用的結(jié)果，其機(jī)理較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步深入的研究。

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