高迪，唐新華，黃京璐，郝博，湯大為，李明，羅斌

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080；2.東源縣公安局，廣東東源 517500）

·論著·

病毒性心肌炎致死者心肌中VCAM-1和caspase-3的表達(dá)

高迪1，唐新華2，黃京璐1，郝博1，湯大為1，李明1，羅斌1

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080；2.東源縣公安局，廣東東源 517500）

目的觀察病毒性心肌炎致死者心肌組織中血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達(dá)及分布特點(diǎn)，探討病毒性心肌炎的發(fā)病、致死機(jī)制。方法收集病毒性心肌炎致死案例20例作為實(shí)驗(yàn)組，交通事故致創(chuàng)傷性、失血性休克死亡案例10例作為對(duì)照組，取心肌組織切片進(jìn)行VCAM-1及caspase-3免疫組織化學(xué)染色后顯微鏡下觀察，經(jīng)圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，比較兩組染色后VCAM-1及caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的差異。結(jié)果（1）實(shí)驗(yàn)組VCAM-1免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性表達(dá)呈深棕黃色，染色部位主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，對(duì)照組呈微弱陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組平均光密度高于對(duì)照組（P＜0.05）。（2）實(shí)驗(yàn)組caspase-3免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性表達(dá)為棕紅色顆粒，主要位于心肌血管周圍炎癥細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論VCAM-1可能在病毒性心肌炎引起的炎癥細(xì)胞滲出過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可為病毒性心肌炎致死案例中的法醫(yī)病理學(xué)診斷提供參考，而caspase-3介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡參與病毒性心肌炎晚期致死機(jī)制的作用不明顯。

法醫(yī)病理學(xué)；血管細(xì)胞黏附分子-1；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；細(xì)胞凋亡；病毒性心肌炎

病毒性心肌炎主要是由柯薩奇病毒（A、B族）、?？刹《荆‥CHO）、脊髓灰質(zhì)炎病毒等引起的心肌局限性或彌漫性的感染，嚴(yán)重地威脅著人類健康，尤其是男性青壯年。病毒性心肌炎的病理改變主要以心肌細(xì)胞變性、壞死及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化為主，然而其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1]。本研究通過(guò)觀察病毒性心肌炎致死者心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)、血管周圍炎癥細(xì)胞的滲出及心肌組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達(dá)，探討病毒性心肌炎的早期發(fā)病機(jī)制及致死機(jī)制，旨在為病毒性心肌炎的法醫(yī)病理診斷及相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

收集2006—2011年中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心尸檢后診斷為病毒性心肌炎致死的案例20例，作為實(shí)驗(yàn)組；因車禍致創(chuàng)傷性休克或失血性休克死亡且心臟無(wú)基礎(chǔ)病變的案例10例，作為對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)組中男性11例，女性9例，年齡為7～53歲。根據(jù)案情資料，實(shí)驗(yàn)組多以發(fā)熱、感冒、胸痛等為主要首發(fā)癥狀，部分病例還伴有頭痛、腹痛、心悸、嘔吐、腹瀉等癥狀；尸檢時(shí)尸斑明顯、雙手指甲床發(fā)紺，體表除醫(yī)源性損傷外未見(jiàn)明顯機(jī)械性損傷，腦、肝、脾、肺、腎等重要器官淤血，余未見(jiàn)明顯異常。對(duì)照組男性8例，女性2例，年齡為20～57歲，未見(jiàn)上述癥狀表現(xiàn)。

1.2 試劑

兔VCAM-1多克隆抗體（0.2 mL，武漢博士德生物工程有限公司），兔caspase-3單克隆抗體（100μg，美國(guó)賽信通公司），生物素化的羊抗兔IgG抗體、即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 HE染色及免疫組織化學(xué)染色

低溫保存尸體1～3d后提取心肌組織，并置于10%甲醛溶液中固定72h后制成蠟塊保存。按常規(guī)制作切片后，分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

免疫組織化學(xué)染色按照SABC試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PBS緩沖液取代一抗作為空白對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

隨機(jī)選取每張切片中5個(gè)陽(yáng)性表達(dá)血管視野（×200），使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1抗體陽(yáng)性反應(yīng)物的平均光密度值及血管周圍caspase-3抗體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，數(shù)據(jù)用±s表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，以t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組心外膜下、肌層、心內(nèi)膜見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，部分心肌組織呈灶樣壞死，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血，可見(jiàn)廣泛性淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心臟傳導(dǎo)組織中竇房結(jié)、房室結(jié)及希氏束區(qū)也可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組未見(jiàn)該形態(tài)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 VCAM-1染色

實(shí)驗(yàn)組心肌間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈VCAM-1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)物位于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，呈深棕黃色（圖1A），對(duì)照組心肌間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈VCAM-1微弱陽(yáng)性表達(dá)（圖1B）。兩組平均光密度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖1 VCAM-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果SABC×200

表1 VCAM-1免疫組織化學(xué)平均光密度（±s）

表1 VCAM-1免疫組織化學(xué)平均光密度（±s）

組別例數(shù)平均光密度實(shí)驗(yàn)200.2626±0.0190對(duì)照100.1768±0.0064

2.2.2 caspase-3染色

實(shí)驗(yàn)組VCAM-1抗體免疫組織化學(xué)表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的心肌組織中心肌細(xì)胞幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，但血管周圍可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞caspase-3表達(dá)陽(yáng)性（圖2A），對(duì)照組VCAM-1抗體免疫組織化學(xué)表達(dá)微弱陽(yáng)性的心肌組織中幾乎無(wú)caspase-3陽(yáng)性表達(dá)（圖2B）。兩組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

圖2 caspase-3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果SABC×200

表2 caspase-3免疫組織化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

表2 caspase-3免疫組織化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

組別例數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)20139.5417±50.1179對(duì)照101.2183±0.3927

3 討論

近年來(lái)，由病毒性心肌炎導(dǎo)致的青壯年心源性猝死較為常見(jiàn)[2-3]。目前研究[1，4-5]發(fā)現(xiàn)，病毒復(fù)制、炎性介質(zhì)、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、免疫調(diào)控失衡、心肌纖維化等多種因素參與病毒性心肌炎的發(fā)病及致死機(jī)制。病理性細(xì)胞凋亡在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用近年來(lái)受到重視，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。

細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAM）是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的膜表面糖蛋白的統(tǒng)稱，以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用。VCAM-1則是一類糖蛋白分子，是細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白家族的重要成員之一，廣泛分布于細(xì)胞因子活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面及上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面。VCAM-1參與淋巴細(xì)胞的活化和遷移，在炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移、自身免疫性疾病等病理過(guò)程中也起重要作用[6]，在炎癥反應(yīng)中淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集上有重要作用，參與單核-吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的炎癥部位浸潤(rùn)，其在血管內(nèi)皮上的表達(dá)也被認(rèn)為是炎癥細(xì)胞從血管進(jìn)入炎癥區(qū)所必需的。正常情況下VCAM-1會(huì)有少量表達(dá)，但炎癥病理?xiàng)l件下表達(dá)會(huì)顯著增多。VCAM-1與其配體極遲反應(yīng)抗原-4 （very late antigen-4，VLA-4）相結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)活性，VLA-4主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞等單核細(xì)胞上。VCAM-1與細(xì)胞表面的VLA-4結(jié)合，使淋巴細(xì)胞黏附在內(nèi)皮細(xì)胞表面，引起淋巴細(xì)胞活化，通過(guò)釋放多種顆粒物質(zhì)，破壞內(nèi)皮細(xì)胞基底膜使膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞溶解，導(dǎo)致血管內(nèi)皮滲透性增加，淋巴細(xì)胞便可以從血管大量滲出，到達(dá)炎癥病灶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組心肌間質(zhì)血管內(nèi)皮VCAM-1表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，證明病毒性心肌炎血管周圍炎癥細(xì)胞聚集與VCAM-1升高有關(guān)。大量的炎癥細(xì)胞（主要為淋巴細(xì)胞）聚集在心肌微血管內(nèi)并浸潤(rùn)到心肌組織中，可釋放細(xì)胞炎性物質(zhì)、氧自由基和蛋白酶等物質(zhì)，引起心肌損傷致死；同時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致心功能障礙。為了證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡所致的損傷和炎癥細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)造成的損傷類型，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)病毒性心肌炎組織進(jìn)行caspase-3免疫組織化學(xué)染色。

細(xì)胞凋亡是一種基因控制的細(xì)胞自殺過(guò)程，在此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生許多凋亡執(zhí)行因子，caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的執(zhí)行因子，其中caspase-3是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最強(qiáng)大的效應(yīng)因子，caspase-3的激活可以作為鑒定凋亡發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)之一[7-8]。caspase-3既參與凋亡啟動(dòng)，又參與凋亡程序執(zhí)行，尤其在凋亡執(zhí)行階段，負(fù)責(zé)對(duì)全部或部分關(guān)鍵蛋白進(jìn)行酶切（激活或滅活），與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。其機(jī)制可能為：caspase-3能誘導(dǎo)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞自穩(wěn)功能嚴(yán)重失調(diào)和影響修復(fù)過(guò)程，最終使細(xì)胞解體[9]。Wang等[10-12]報(bào)道在柯薩奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）感染的實(shí)驗(yàn)小鼠心肌組織中caspase-3的表達(dá)與細(xì)胞凋亡相關(guān)，且caspase-3的表達(dá)與細(xì)胞凋亡強(qiáng)度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組心肌細(xì)胞幾乎未見(jiàn)caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)，但在實(shí)驗(yàn)組心肌間質(zhì)血管周圍的炎癥細(xì)胞見(jiàn)顯著的caspase-3表達(dá)。由此可以推斷心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制在病毒性心肌炎的晚期致死機(jī)制中作用不明顯，而病毒的直接復(fù)制及炎性介質(zhì)參與的免疫作用溶解感染的心肌細(xì)胞可能為病毒性心肌炎的主要致死機(jī)制[13]。

本研究提示VCAM-1作為一項(xiàng)指標(biāo)對(duì)診斷因病毒性心肌炎導(dǎo)致的心源性猝死具有法醫(yī)學(xué)意義。病毒性心肌炎致死機(jī)制并非以心肌細(xì)胞的凋亡為主，而是由炎癥介質(zhì)參與的免疫機(jī)制造成的心肌損害為主，其具體免疫機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Expression of VCAM-1 and Caspase-3 in Myocardium of Persons Who Died from Viral Myocarditis

GAO Di1,TANG Xin-hua2,HUANG Jing-lu1,HAO Bo1,TANG Da-wei1,LI Ming1,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Dongyuan Public Security Bureau,Dongyuan 517500,China）

ObjectiveTo observe the expression and distribution of vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1）and caspase-3 in myocardium of persons who died from viral myocarditis and to explore its pathogenesis and death mechanism.MethodsTwenty cases died from viral myocarditis were selected as the experimental group.Ten cases died from traumatic shock and massive hemorrhage shock after traffic accidents were selected as the control group.The sections of myocardium were stained by immunohistochemistry for VCAM-1 and caspase-3,and observed under microscope.The positive expressions of VCAM-1 and caspase-3 of the two groups were compared with each other by image analysis and statistical analysis.Results（1）The vascular endothelial cells expressed VCAM-1 with dark nigger-brown colors in the experimental group,and weak expression was observed in the control group.The average optical density in the experimental group was higher than that in the control group（P＜0.05）.（2）The caspase-3 positive cells were mostly inflammatory cells around the myocardial vessels with brown-red granules in the experimental group.The positive cell number in the experimental group was higher than that in the control group（P＜0.05）.ConclusionVCAM-1 may play an important role in the inflammatory cells exudation caused by viral myocarditis,and may provide the reference for diagnosis of viral myocarditis in forensic pathology.However,the myocardial apoptosis mediated by caspase-3 doesn’t affect the lethal mechanism in the late stage of viral myocarditis.

forensic pathology;vascular cell adhesion molecule-1;caspase-3;apoptosis;vital myocarditis

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.001

1004-5619（2013）03-0161-03

2012-11-09）

（本文編輯：劉寧國(guó)）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39700167）

高迪（1985—），男，山東龍口人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：gaodi2008@qq.com

羅斌，男，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)（猝死疾?。┭芯浚籈-mail：luobin@mail.sysu.edu.cn