李鋒濤，程斌，李浩鵬，臧全金，張廷，賀西京

·基礎(chǔ)研究·

咯利普蘭治療大鼠脊髓橫斷損傷的實(shí)驗(yàn)研究①

李鋒濤1a，程斌1b，李浩鵬1a，臧全金1a，張廷1a，賀西京1a

目的 探索咯利普蘭治療大鼠脊髓橫斷損傷的可行性。方法取健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、損傷組(SCI組)、咯利普蘭治療組(R組)，每組10只。R組建立大鼠脊髓橫斷損傷模型后立刻皮下注射咯利普蘭；Sham組僅打開(kāi)椎板；SCI組及Sham組皮下注射相同體積二甲基亞砜(DMSO)。于損傷后2、4、6、8周采用BBB評(píng)分法觀察大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能情況，損傷后2周時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(GAP-43)及膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。結(jié)果損傷后6周、8周時(shí)，R組BBB評(píng)分優(yōu)于SCI組(P＜0.05)。損傷后2周，R組GAP-43表達(dá)高于SCI組(P＜0.05)，GFAP表達(dá)量低于SCI組(P＜0.05)。結(jié)論咯利普蘭能提高大鼠脊髓橫斷損傷神經(jīng)功能評(píng)分，提高GAP-43表達(dá)，抑制GFAP表達(dá)。

脊髓損傷；咯利普蘭；運(yùn)動(dòng)功能；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43；膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白；大鼠

[本文著錄格式]李鋒濤，程斌，李浩鵬，等.咯利普蘭治療大鼠脊髓橫斷損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19 (7):628-630.

研究發(fā)現(xiàn)，提高神經(jīng)元胞體內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量，可促進(jìn)脊髓背根神經(jīng)節(jié)損傷后新生軸突在抑制性環(huán)境中的生長(zhǎng)[1]?？├仗m(rolipram)是第一代磷酸二酯酶Ⅳ(PDEⅣ)特異性抑制劑，可通過(guò)特異性抑制PDEⅣ對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水解作用，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，發(fā)揮多種生理作用，如抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制凋亡等。本實(shí)驗(yàn)觀察咯利普蘭對(duì)大鼠脊髓橫斷損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein 43, GAP-43)及膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；咯利普蘭：美國(guó)SIGMA公司；圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)：德國(guó)LEICA公司。

1.2 動(dòng)物分組及造模

成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠30只，體重(225±23)g，購(gòu)買(mǎi)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組，n=10)、損傷對(duì)照組(SCI組，n=10)、咯利普蘭治療組(R組，n=10)。

所有動(dòng)物術(shù)前禁食過(guò)夜，自由飲水。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉。將動(dòng)物固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，以T9為中心取背側(cè)正中切口，切除T9、T10全椎板，暴露脊髓組織。找出T9、T10椎間盤(pán)，從脊髓一側(cè)用小圓針0號(hào)絲線穿過(guò)T9、T10椎間盤(pán)組織，并從另一側(cè)出來(lái)，于絲線頭側(cè)1 mm(T9水平)處橫向切斷脊髓組織及部分椎間盤(pán)，無(wú)阻力提出預(yù)置線，確保脊髓組織完全橫斷。7-0無(wú)損傷線縫合損傷區(qū)兩側(cè)的硬脊膜，棉簽壓迫止血，生理鹽水沖洗傷口；依次縫合傷口。Sham組僅打開(kāi)椎板暴露脊髓，不損傷脊髓。術(shù)后每日人工膀胱按摩2次，直至膀胱排尿反射恢復(fù)。術(shù)后3只大鼠因泌尿系感染死亡，其中R組1只，SCI組2只，均按相同條件予以補(bǔ)充。

1.3 治療方法

將咯利普蘭溶于二甲基亞砜(DMSO)中。R組于建模后立即皮下注射0.5 mg/kg·d，分4次注射，共10 d。其余各組按相同方法于皮下注射同體積DMSO。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 采用雙人雙盲取平均值的方法，按照BBB評(píng)分法分別于損傷后2、4、6、8周對(duì)各組動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色 損傷后2周時(shí)處死動(dòng)物(每組5只)，4%多聚甲醛灌注，取出T9節(jié)段脊髓，石蠟包埋，于損傷頭尾側(cè)2 mm范圍內(nèi)連續(xù)切片，厚10 μm。按照試劑盒操作步驟分別進(jìn)行GAP-43及GFAP免疫組織化學(xué)染色。應(yīng)用LEICA Q500IW圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

損傷后2周時(shí)，除Sham組外，其他各組動(dòng)物后肢BBB評(píng)分為0分；4周時(shí)，后肢運(yùn)動(dòng)功能有輕微恢復(fù)，R組與SCI組之間無(wú)顯著性差異(t=1.13,P＞0.05)；6周、8周時(shí)，R組與SCI組間有顯著性差異(t=2.34,P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠后肢神經(jīng)BBB評(píng)分比較

2.2 免疫組織化學(xué)染色

2.2.1 GAP-43 Sham組有少量GAP-43蛋白表達(dá)于神經(jīng)元胞漿中。各損傷組動(dòng)物脊髓組織中GAP-43蛋白表達(dá)較Sham組明顯增加，以R組表達(dá)量最多。見(jiàn)圖1、表2。

2.2.2 GFAP Sham組有少量GFAP陽(yáng)性膠質(zhì)細(xì)胞散在分布于灰質(zhì)和白質(zhì)中。SCI組GFAP陽(yáng)性膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，排列不整，形成明顯的瘢痕組織。R組較SCI組GFAP陽(yáng)性膠質(zhì)細(xì)胞著色較淺，數(shù)量較少。見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組GFAP及GAP-43表達(dá)比較(平均灰度值)

圖1 各組治療后2周GAP-43表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖2 各組治療后2周GFAP表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

3 討論

SCI后軸突再生失敗的原因主要有兩個(gè)：損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的抑制性因素，如NogoA、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)等的抑制作用，以及有限的軸突再生能力(局部神經(jīng)細(xì)胞的大量壞死和凋亡、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏等)。雖然損傷區(qū)殘存的軸突可發(fā)芽生長(zhǎng)較短距離[2]，但這些再生的軸突生長(zhǎng)錐由于缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的支持，以及受到髓鞘抑制性分子、膠質(zhì)瘢痕的化學(xué)性和物理性抑制等，很快發(fā)生萎縮[3-4]，不能形成較長(zhǎng)距離的新生軸突穿出損傷區(qū)與靶細(xì)胞發(fā)生突觸連接，使再生失敗。

研究發(fā)現(xiàn)，提高神經(jīng)元胞體內(nèi)cAMP的含量，可促進(jìn)脊髓背根神經(jīng)節(jié)損傷后新生軸突在抑制性環(huán)境中的生長(zhǎng)[1]。細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的升高，激活蛋白激酶A(PKA)和絲裂原激活蛋白激酶(MEK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路，使轉(zhuǎn)錄因子cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)發(fā)生磷酸化而被活化?；罨腃REB可引起相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使新生軸突抵抗MAG和髓鞘的抑制而再生。

咯利普蘭可通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)PDEⅣ，減少cAMP的水解，引起多種生物學(xué)功能：①減少前炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-13、IL-5、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素(IFN-γ)的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)；②降低血腦屏障的通透性，減少炎性細(xì)胞及有害因子穿過(guò)血腦屏障引起的組織損傷；③降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，減少一氧化氮(NO)等超氧化合物的生成[5]；④激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，抑制促凋亡蛋白Bad和caspase-3的活化，同時(shí)使Bcl-2磷酸化而被激活，從而減少細(xì)胞凋亡；⑤促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后新生軸突克服抑制性分子如Nogo、MAG和OMgp的抑制而生長(zhǎng)。此外，咯利普蘭還可阻止Ca2+內(nèi)流，減少Ca2+介導(dǎo)的死亡通路，抑制損傷區(qū)軸突脫髓鞘作用。Antonio等應(yīng)用咯利普蘭治療大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，可明顯抑制EAE動(dòng)物脊髓和淋巴結(jié)內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)基因的轉(zhuǎn)錄，降低核因子(NF-κB)的表達(dá)水平，抑制炎性細(xì)胞因子的合成[6]。Folcik等發(fā)現(xiàn)，咯利普蘭可降低大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮通透性，阻止炎性細(xì)胞的侵潤(rùn)，減輕組織水腫[7]。Nikulina等發(fā)現(xiàn)，咯利普蘭在體外可克服MAG或者髓鞘對(duì)神經(jīng)元的抑制作用，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)[8]。

本研究顯示，咯利普蘭能改善大鼠脊髓橫斷損傷后的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，提高GAP-43的表達(dá)，抑制GFAP的合成，提示抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，為神經(jīng)軸突生長(zhǎng)提供一定的條件。

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Effects of Rolipram on Spinal Cord Transection Injury in Rats

LI Feng-tаo,CHENG Bin,LI Hаo-peng,et аl.Depаrtment of Orthopedics,the Second Hospitаl of Xi'аn Jiаotong University,Xi'аn 710004,Shааnxi,Chinа

ObjectiveTo investigate the possibility of rolipram for treatment of spinal cord injury(SCI)in rats.Methods30 adult female Sprague-Dawley rats were divided into sham-operation group(sham group,n=10),spinal cord injury group(SCI group,n=10)and rolipram treatment group(R group,n=10).The rats in SCI group and R group were modeled as spinal cord transection injury,and R group was administrated with rolipram subcutaneouly after SCI.They were assessed with Basso Beattie and Bresnahan(BBB)score 2,4,6,and 8 weeks after SCI,and the expressions of growth associated protein 43(GAP-43)and glial fibrillary acidic protein(GFAP)were detected with immunohistochemistry 2 weeks after SCI.ResultsThere were significant difference in the BBB scores between SCI and R groups 6 and 8 weeks after SCI(P＜0.05).The expression of GAP-43 was more and GFAP was less in R group than in SCI group(P＜0.05).ConclusionRolipram can increase the expression of GAP-43 and inhibit the expression of GFAP,while improves the the motor function in rats after spinal cord transsection injury.

spinal cord injury;rolipram;motor function;growth associated protein 43;glial fibrillary acidic protein;rats

R681.2

A

1006-9771(2013)07-0628-03

2012-07-19

2012-11-28)

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，a.骨二科；b.骨三科，陜西西安市710004。作者簡(jiǎn)介：李鋒濤(1980-)，男，陜西興平市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：脊柱外科。通訊作者：賀西京，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：脊柱外科。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.07.009