佟萬(wàn)兵，曹龍奎*，宋 亮

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取玉米蛋白粉中葉黃素工藝

佟萬(wàn)兵，曹龍奎*，宋 亮

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

為獲得純度較高的葉黃素，以玉米蛋白粉為原料，對(duì)玉米葉黃素的超臨界CO2萃取工藝條件進(jìn)行研究，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定葉黃素純度。用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超臨界CO2萃取葉黃素的工藝參數(shù)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取壓力3個(gè)主要因素，以葉黃素純度為響應(yīng)值，對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出了最優(yōu)提取工藝條件為：萃取時(shí)間2.3h、萃取溫度42℃、萃取壓力30MPa、夾帶劑為90%乙醇、添加量5mL/100g。在該條件下，由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的玉米葉黃素純度為46.50%。

葉黃素；超臨界CO2萃取；響應(yīng)面法

玉米蛋白粉是濕法生產(chǎn)玉米淀粉過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，其中含有豐富的葉黃素[1]。如用來(lái)提取葉黃素不僅可以大大提高其附加值還可解決環(huán)境污染問(wèn)題。葉黃素又名“植物黃體素”，是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物中的天然色素，具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、安全無(wú)毒、抗氧化能力強(qiáng)、可預(yù)防人體衰老、富有營(yíng)養(yǎng)無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，所以越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2-5]。超臨界CO2萃取技術(shù)是最近在食品工業(yè)上新興的一項(xiàng)萃取和分離技術(shù)。與傳統(tǒng)的溶劑萃取相比，其優(yōu)越性在于無(wú)化學(xué)溶劑消耗和殘留，無(wú)污染，減少萃取物在高溫下的劣變，保護(hù)生物活性物質(zhì)的活性，工藝簡(jiǎn)單、能耗低、萃取劑無(wú)毒、易回收[6-7]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)葉黃素的研究較多，但利用玉米蛋白粉為原料提取葉黃素的研究并不多，盧艷杰等[8]研究了利用溶劑萃取法提取玉米蛋白粉中的黃體素和玉米黃素；李秀霞等[9]研究了采用酶法預(yù)處理玉米蛋白粉輔助常規(guī)溶劑提取葉黃素的工藝，但都不可避免地存在有機(jī)溶劑的殘留，影響產(chǎn)品質(zhì)量。綦丹華等[10]研究了超臨界流體萃取玉米蛋白粉中類胡蘿卜素(葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素)的提取工藝，得出了超臨界萃取類胡蘿卜素最佳提取工藝，研究中將萃取物與萬(wàn)壽菊提取物中葉黃質(zhì)含量進(jìn)行了比較，結(jié)果表明利用玉米蛋白粉作為原料具有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但本研究以含量作為考察指標(biāo)，3個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物含量均較低。王世寬等[11]研究了溶劑法與超臨界CO2萃取玉米蛋白粉中黃色素的工藝比較并得出結(jié)論：超臨界CO2法萃取玉米黃色素的得率明顯高于溶劑法，但黃色素為一種含有葉黃素的色素混合物，不能很好的滿足食品醫(yī)藥等行業(yè)的需要。馬志虎等[12]研究了利用超臨界法萃取栝樓皮中葉黃素的工藝條件，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化并進(jìn)行了栝樓皮葉黃素的穩(wěn)定性研究，但未研究夾帶劑濃度對(duì)葉黃素萃取效果的影響，且采用分光光度計(jì)法定量，由于各種類胡蘿卜素在紫外-可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍有不同程度的吸收，因此分光光度法測(cè)的是混合物的吸光度，不適宜作為葉黃素的定量定性方法。本實(shí)驗(yàn)以葉黃素純度為考察指標(biāo)，采用C30柱作為固定相的HPLC法[13]對(duì)玉米葉黃素的純度進(jìn)行了測(cè)定分析[14]，對(duì)玉米蛋白粉中葉黃素的提取工藝參數(shù)進(jìn)行研究，旨在得到一種快速、高效、綠色環(huán)保且葉黃素純度較高的提取工藝，以滿足食品醫(yī)藥等行業(yè)對(duì)葉黃素的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉 黑龍江昊天玉米開(kāi)發(fā)有限公司；CO2氣體(純度99.99%) 大慶雪龍氣體股份有限公司；乙醇、丙酮均為國(guó)產(chǎn)分析純；甲基叔丁基醚、甲醇為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

hA121-50-01超臨界萃取裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；JD100-38電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；1200高效液相色譜裝置 美國(guó)安捷倫公司；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 超臨界CO2萃取

在超臨界CO2萃取分離過(guò)程中，對(duì)工藝影響較大的因素主要有壓力、溫度、時(shí)間、CO2流量、夾帶劑體積分?jǐn)?shù)、物料與夾帶劑的比例。玉米葉黃素分子中含有兩個(gè)羥基，因此具有一定的極性。為了增加超臨界流體CO2的極性，提高葉黃素的純度，增強(qiáng)萃取效果，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加一定量的夾帶劑，常用的夾帶劑有甲醇、乙醇、丙酮、丙烷等，丙酮或乙醇均可得到滿意的提取效果，但丙酮易揮發(fā)、易燃，從食品安全性考慮，選用乙醇作為夾帶劑，添加量為5mL/100g[15]。

準(zhǔn)確稱取300g玉米蛋白粉，加入超臨界萃取釜中，稱取15mL乙醇作為夾帶劑，在溫度45℃、壓力30MPa條件下萃取3h，收集分離釜中的萃取液，進(jìn)行前處理用高效液相色譜檢測(cè)其純度。固定其他條件，分別考察萃取壓力(20～40MPa)、萃取溫度(30～50℃)、萃取時(shí)間(1～5h)、夾帶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)(80%～99.7%)對(duì)葉黃素純度的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以葉黃素純度為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化得出超臨界萃取玉米葉黃素最佳工藝參數(shù)。

1.4 樣品的前處理及其測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定量萃取液，加入相同體積丙酮，待萃取液澄清后進(jìn)行高速離心，吸取上清液以0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.5 葉黃素純度的高效液相色譜分析

根據(jù)趙顯峰等[16]的描述的方法改進(jìn)。色譜條件：流動(dòng)相：A相：甲基叔丁基醚；B相：甲醇-水(體積比為81:4)；洗脫梯度為：0～40min內(nèi)B由81%逐漸減少為11%， 0～40min內(nèi)A由15%逐漸增加為85%；水全程為4%。色譜柱為C30柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：450nm；流速：0.85mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對(duì)葉黃素純度的影響

2.1.1 萃取溫度對(duì)葉黃素純度的影響

圖1 萃取溫度對(duì)葉黃素純度的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on lutein purity

由圖1可知，在萃取壓力30MPa的條件下，當(dāng)溫度為30～40℃時(shí)玉米葉黃素的純度隨溫度的增加而升高，40℃時(shí)達(dá)到最大值(42.72%)，并顯著高于其他溫度下的純度(P＜0.05)。40℃后，隨著溫度的升高，純度逐漸下降。這是因?yàn)檩腿囟葘?duì)超臨界流體溶解能力影響比較復(fù)雜，一方面升高溫度，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，溶質(zhì)的傳質(zhì)系數(shù)、揮發(fā)度和擴(kuò)散速度提高，而且葉黃素?fù)]發(fā)性增加，這樣就增加了被萃取物在超臨界氣相中的濃度，從而使萃取量增大，提取率逐漸升高。另一方面，溫度升高，超臨界流體密度降低，導(dǎo)致流體溶解能力降低，從而使化學(xué)組分溶解度減小，對(duì)萃取不利，導(dǎo)致萃取數(shù)減少，因此在40℃以后葉黃素純度降低。因此選取萃取溫度為40℃，提取效果最好[17-18]。

2.1.2 萃取壓力對(duì)葉黃素純度的影響

圖2 萃取壓力對(duì)葉黃素純度的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on lutein purity

由圖2可知，在萃取溫度為45℃、時(shí)間為3h的條件下，在15～20MPa范圍內(nèi)葉黃素純度隨萃取壓力的增加而升高，這是由于隨著萃取壓力的增加超臨界流體密度增大，對(duì)葉黃素的溶解能力增強(qiáng)。當(dāng)萃取壓力上升到20MPa時(shí)葉黃素的純度達(dá)到最高(39.68%)，當(dāng)壓力超過(guò)20MPa時(shí)，葉黃素純度又呈下降趨勢(shì)，這是由于壓力過(guò)大，擴(kuò)散系數(shù)減小，阻礙傳質(zhì)，并且壓力增大流體流量會(huì)升高，減小了超臨界CO2在物料中的傳質(zhì)時(shí)間，這在一定程度上影響葉黃素純度[18]。因此，超臨界CO2萃取葉黃素較好的萃取壓力為20MPa。

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)葉黃素純度的影響

圖3 萃取時(shí)間對(duì)葉黃素純度的影響Fig.3 Effect of extraction time on lutein purity

由圖3可知，在萃取溫度45℃、壓力30MPa的條件下，在初始階段，玉米葉黃素純度較低，到2h時(shí)達(dá)到最大值(48.37%)，2h后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，葉黃素純度有所下降，3～5h提取時(shí)間下的葉黃素純度差異不顯著(P＞0.05)，從節(jié)約成本，提高提取效率方面考慮，選擇萃取時(shí)間為2h。

2.1.4 夾帶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)葉黃素純度的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葉黃素純度的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on lutein purity

由圖4可知，在萃取溫度45℃、壓力30MPa的條件下，隨著夾帶劑體積分?jǐn)?shù)的增加，葉黃素純度先增大后減小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)葉黃素純度最高(43.56%)，顯著高于其他濃度條件下的葉黃素純度(P＜0.05)。原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)水分較多，帶出了許多水溶性雜質(zhì)，故使純度偏低，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)等溶出量增加，這些成分與葉黃素競(jìng)爭(zhēng)同乙醇分子結(jié)合從而導(dǎo)致純度下降[19]。因此綜合經(jīng)濟(jì)效益和現(xiàn)實(shí)可行性，選擇夾帶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為90%。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化玉米葉黃素萃取工藝條件

2.2.1 分析因素的選取及分析方案

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定夾帶劑體積分?jǐn)?shù)為90%，選取萃取時(shí)間、萃取溫度和萃取壓力對(duì)葉黃素提取影響的3個(gè)顯著因素，分別以A、B和C代表，每一個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，如表1所示，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 葉黃素提取響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Factors and levels used in response surface analysis

2.2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

表2 葉黃素提取響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design Expert軟件，通過(guò)表2中葉黃素純度試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得葉黃素純度對(duì)編碼自變量萃取時(shí)間、萃取溫度和萃取壓力的回歸方程為：Y＝-202.87810＋23.93660A＋10.25202B＋0.27270C-0.069500AB-0.13750AC＋0.027900BC-2.77985A2-0.13139B2-0.018794C2。由表3可知，整體模型的P值小于0.01，表明該二次方程模型高度顯著。萃取時(shí)間和萃取溫度影響高度顯著，而萃取壓力較不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序，萃取溫度＞萃取時(shí)間＞萃取壓力。

由表3可知，回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著，并且該模型的R2＝0.9806，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于玉米葉黃素提取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型方程的方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 因素間的交互影響

圖5 各因素交互影響的等高線和響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of temperature, pressure and time on lutein purity

圖5直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。比較3組圖可知，萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)葉黃素純度的影響顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；萃取壓力對(duì)葉黃素純度的影響不顯著，其表現(xiàn)為曲線較為平緩；由萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)葉黃素純度的交互效應(yīng)可知，隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)和萃取溫度的升高，葉黃素純度逐漸提高，但當(dāng)兩者增大到一定程度(萃取時(shí)間約2.3h左右，萃取溫度約42℃左右)時(shí)，葉黃素純度反而下降。從其等高線圖可以直觀地看出該兩個(gè)因素的交互作用不顯著，在編碼值為0以上的萃取溫度在萃取時(shí)間的一定范圍內(nèi)都能夠得到較大的響應(yīng)值。萃取時(shí)間和萃取壓力交互效應(yīng)顯示了萃取溫度為25℃時(shí)，隨萃取時(shí)間的增加和萃取壓力的升高，葉黃素純度逐漸提高，但當(dāng)兩者增大到一定程度(萃取時(shí)間約2.3h左右，萃取壓力約30MPa左右)時(shí)，葉黃素純度反而下降。從其等高線圖可以直觀地看出該兩個(gè)因素的交互作用不大，在編碼值為0以上的萃取壓力在萃取時(shí)間的一定范圍內(nèi)都能夠得到較大的響應(yīng)值。萃取溫度和萃取壓力顯示了萃取時(shí)間為3h時(shí)，隨萃取溫度的升高和萃取壓力的增大，葉黃素純度逐漸提高，但當(dāng)兩者增大到一定程度(萃取溫度約42℃左右，萃取壓力約30MPa左右)時(shí)，葉黃素純度反而下降。從其等高線圖可以直觀地看出該兩個(gè)因素的交互作用不大，在編碼值為0以上的萃取壓力在萃取溫度的一定范圍內(nèi)都能夠得到較大的響應(yīng)值。

2.2.4 葉黃素提取工藝條件的確定

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0.4求解方程，得出了最優(yōu)提取工藝條件為：萃取時(shí)間2.29h、萃取溫度41.56℃、萃取壓力29.74MPa。在該條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的葉黃素純度為46.48%?？紤]到實(shí)際操作的可行性并取得最佳效果的目的，將葉黃素的提取工藝條件修正為：萃取時(shí)間2.3h、萃取溫度42℃、萃取壓力30MPa。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用修正條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得出葉黃素的實(shí)際純度為46.50%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。因此，利用響應(yīng)面分析法得到的葉黃素提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

3.1 本研究所選取的夾帶劑為乙醇，萃取效果最好，且價(jià)格低廉，毒性小，提取后的玉米蛋白粉仍可繼續(xù)作為飼料使用，有效的提高了玉米蛋白粉的附加值。

3.2 應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化葉黃素的提取工藝，結(jié)果顯示，以純度為指標(biāo)的葉黃素提取最佳工藝參數(shù)為：萃取時(shí)間2.3h、萃取溫度42℃、萃取壓力30MPa。

3.3 超臨界CO2萃取玉米葉黃素的最佳工藝條件為：夾帶劑90%乙醇、添加量5mL/100g、萃取時(shí)間2.3h、萃取溫度42℃、萃取壓力30MPa，此時(shí)葉黃素的純度為46.50%。

3.4 在萃取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未用到對(duì)人體有害的有機(jī)溶劑，避免了有害溶劑的微量殘留，提取到的葉黃素產(chǎn)品更加安全。因此，超臨界CO2萃取玉米葉黃素是一種快速、高效、綠色環(huán)保的提取方法。

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Optimization of Supercritical CO2Extraction of Lutein from Corn Protein Powder by Response Surface Methodology

TONG Wan-bing，CAO Long-kui*，SONG Liang
(College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

The supercritical CO2extraction of lutein from corn protein powder was optimized by response surface methodology. Lutein purity was determined by HPLC. Extraction time, temperature and pressure were identified by onefactor-at-a-time method as main variables that influence extraction efficiency. The optimal extraction conditions were found to be extraction at 42 ℃ and 30 MPa for 2.3 h using 90% ethanol as the entrainer at a dosage of5 mL/100 g. The predicted lutein content (i.e., purity) of extracts under these conditions was 46.50%.

lutein；supercritical CO2extraction；response surface methodology

TS210.1

A

1002-6630(2013)04-0037-05

2011-10-13

“十一五”國(guó)家重大科技專項(xiàng)(2009GB2B200100)

佟萬(wàn)兵(1987—)，男，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：bingge19870820@163.com

*通信作者：曹龍奎(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：longkuicao@yahoo.com.cn