馮 進(jìn)，曾曉雄，李春陽*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉多酚提取工藝

馮 進(jìn)1,2，曾曉雄2，李春陽1,*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

采用乙醇提取藍(lán)莓葉中多酚。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Plackett Burman試驗(yàn)篩選出對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取具有顯著影響的因子：乙醇體積分?jǐn)?shù)(P＝0.0025)、提取溫度(P＝0.0091)、料液比(P＝0.0236)、提取時(shí)間(P＝0.0156)；采用響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)62.05%、提取溫度67.54℃、料液比1:23.65、提取時(shí)間2.06h，在此條件下，多酚提取率為90.49%。同時(shí)，建立了醇提藍(lán)莓葉多酚的二次數(shù)學(xué)模型，對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取具有良好的預(yù)測作用。

藍(lán)莓葉多酚；提取工藝；Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法

藍(lán)莓又名篤斯越橘、藍(lán)漿果等，原產(chǎn)于北美[1]，按照植物學(xué)分類，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘亞科越橘屬(Vaccinium.spp)多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓葉具有藥用價(jià)值，其性溫、味苦，有解毒之功效[2]。藍(lán)莓葉中含有大量的酚類物質(zhì)[3]，多酚具有較強(qiáng)的抗氧化作用，以及抗癌，抗老化等功效[4]，對(duì)人體健康具有積極的意義。Matsuo等[5]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉中多酚主要為低聚原花青素，另外還含有咖啡?？鼘幩?、黃酮苷、黃酮烷-三醇、兒茶素等。Takeshita等[6]研究證明藍(lán)莓葉中聚合度為8和9的原花青素對(duì)丙肝病毒 RNA表達(dá)能力有很強(qiáng)的抑制作用。Squpień等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉提取物對(duì)白血病敏感細(xì)胞HL60及其兩種抗藥亞種具有抑制作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉多酚提取物有降血脂[9]、降血壓的生理活性[10]。目前，國內(nèi)對(duì)藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行了大量的研究，但是對(duì)藍(lán)莓葉的開發(fā)利用卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)、Platkett Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為藍(lán)莓葉中多酚物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓葉采于江蘇省南京市溧水縣，烘干備用。

無水乙醇、丙酮、濃鹽酸、正丁醇、無水碳酸鈉、β-巰基乙醇、SDS、Tris堿 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄籽原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%) 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；Folin-Ciocalteu試劑 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-Q 臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠；DD-5M湘儀離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-500DV數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FW-177型中草藥搗碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；SK-1快速混勻機(jī) 江蘇省金壇市榮華儀器有限公司；752S紫外-可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；PHS-2C數(shù)顯pH計(jì) 上海儀器儀表有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。Eyela FDU-1200冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社。1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓葉中游離態(tài)多酚含量的測定

以原花青素為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)正丁醇-鹽酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用70%丙酮分別配制質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的原花青素溶液，各取1mL加入6mL 95%的正丁醇-鹽酸溶液，沸水浴中反應(yīng)60min，在550nm處測定吸光度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝1.8377X＋0.0496，R2＝0.9951。

藍(lán)莓葉游離態(tài)多酚的提取與測定參照Porter等[11]的方法略有改動(dòng)。取藍(lán)莓葉200mg，加入20mL 70%的丙酮，在50℃下攪拌提取2h，提取3次，合并濾液，定容后取待測液適當(dāng)稀釋后顯色，方法同上。

式中：C1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液中多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為待測液體積/mL；N1為稀釋倍數(shù)；m為藍(lán)莓葉質(zhì)量/g。

1.3.2 藍(lán)莓葉蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)多酚含量的測定

以原花青素為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)正丁醇-鹽酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用SDS-β巰基乙醇混合液分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的原花青素溶液，各取1mL加入6mL 95%的正丁醇-鹽酸溶液，沸水浴中反應(yīng)60min，在550nm波長處測定吸光度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝1.6583X-0.0342，R2＝0.9951。

蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)多酚的提取與測定參照Terril等[12]的方法。在1.3.1節(jié)殘?jiān)?冷凍干燥)中加入20mL SDS-β巰基乙醇混合液，室溫振蕩提取15min，轉(zhuǎn)入沸水浴中提取45min，提取3次，合并上清液，取1mL顯色，方法同上，用95%正丁醇-水溶液代替95%正丁醇-鹽酸做空白對(duì)照。

式中：C2為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液中多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V2為待測液體積/mL；N2為稀釋倍數(shù)；m為藍(lán)莓葉質(zhì)量/g。

1.3.3 藍(lán)莓葉纖維素結(jié)合態(tài)多酚含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作同1.3.2節(jié)，標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y＝1.2261X-0.0274，R2＝0.9913。

纖維素結(jié)合態(tài)多酚的提取與測定參照Giner等[13]的方法，在1.3.1節(jié)的殘?jiān)?冷凍干燥)中加入22mL混合溶液A，在沸水浴中提取60min，提取兩次，冷卻，離心，合并上清液，定容后取待測液適當(dāng)稀釋后顯色，測定方法參照同上，用95%正丁醇-水代替95%正丁醇-鹽酸做空白對(duì)照。

式中：C3為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液中多酚含量/ (mg/mL)；V3為待測液體積/mL；N3為稀釋倍數(shù)；m為藍(lán)莓葉質(zhì)量/g。

1.3.4 藍(lán)莓葉總酚的提取與測定

稱取一定質(zhì)量的藍(lán)莓葉干粉，加入乙醇溶液，在臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器中振蕩提取，離心后合并上清液，定容，濾液過濾膜后取1mL用80%乙醇適當(dāng)稀釋，進(jìn)行多酚含量的測定。

根據(jù)Folin-Ciocalteu法[14]測定提取液中的多酚含量。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝7.2110X＋0.0152，R2＝0.9994。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液中多酚含量/ (mg/mL)；V為待測液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為藍(lán)莓葉質(zhì)量/g。

多酚提取率計(jì)算公式如下：

式中：M為提取液中多酚含量/(mg/g)；M1為游離態(tài)多酚含量/(mg/g)；M2為蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)多酚含量/(mg/g)；M3為纖維素結(jié)合態(tài)多酚含量/(mg/g)。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

稱取2g藍(lán)莓葉粉，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液(pH4)60mL，在50℃恒溫箱中振蕩2h，提取1次，過濾，濾液濃縮、定容，進(jìn)行測定。固定其他條件，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%～100%)提取溫度(30～80℃)、料液比(1:10～1:80)、提取時(shí)間 (0.5～4.5h)、pH值(2～10)、提取次數(shù)(1～4次)對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響。

1.3.6 Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用N=8的Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)上述6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)指標(biāo)為多酚提取率，根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素取3個(gè)水平，編碼水平見表1。

表1 Plakett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table1 Coded values and corresponding real values of the extraction parameters used in Plackett Burman design

1.3.7 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過1.3.6節(jié)設(shè)計(jì)篩選出顯著性影響因素之后，采用Box-Behnken模型，以顯著性影響因素作為考察因子進(jìn)行四因素三水平共29組試驗(yàn)。根據(jù)獲得的回歸模型方程，可分析各因子的主效應(yīng)和因子之間的交互效應(yīng)，同時(shí)，可用響應(yīng)面圖和等高線圖對(duì)模型進(jìn)行直觀的描繪，預(yù)測處藍(lán)莓葉多酚提取率最高的因子組合。編碼水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table2 Coded values and corresponding real values of the extraction parameters used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols

從圖1可以看出，多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增加后減小，在60%時(shí)達(dá)到最大值，為77.56%。根據(jù)相似相溶原理，與藍(lán)莓葉多酚極性相似的溶劑可以使其充分溶于溶劑中從而被提取出來[15]。多酚在植物體內(nèi)常與蛋白質(zhì)等以氫鍵的形式形成穩(wěn)定的復(fù)合物，乙醇體積分?jǐn)?shù)過低，溶劑對(duì)氫鍵的破壞能力不強(qiáng)，從而使提取率降低[16]；乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，溶劑極性低，導(dǎo)致提取率下降，并且會(huì)增加葉綠素等脂溶性物質(zhì)的溶出[2]，給后續(xù)的分離純化工作造成不便。因此，選擇60%的乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響

圖2 提取溫度對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

從圖2可以看出，在30～70℃范圍內(nèi)，多酚提取率隨著溫度的升高而升高，在70℃達(dá)到最高點(diǎn)，提取率為84.45%。溫度進(jìn)一步升高，高溫促使多酚類物質(zhì)的氧化變性，因此，多酚提取率有著明顯的下降，80℃多酚提取率同70℃多酚提取率有著顯著性差異(P＜0.05)，因此，選擇70℃作為最佳提取溫度。

2.1.3 料液比對(duì)多酚提取率的影響

圖3 料液比對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

從圖3可以看出，料液比在1:10～1:30的范圍內(nèi)，多酚的提取率有著顯著性的提高，繼續(xù)提高料液比對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率無顯著性影響。另外，料液比過大也會(huì)造成資源的浪費(fèi)并對(duì)后續(xù)的分離純化不利。因此，最佳料液比為1:30。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

從圖4可以看出，在2h內(nèi)，多酚提取率隨提取時(shí)間的延長而增大，提取時(shí)間為2h使提取率最大為81.79%。當(dāng)提取時(shí)間為2.5h時(shí)，藍(lán)莓葉多酚提取率較2h比較差異不顯著(P＜0.05)，在3.5h時(shí)提取率有所回升，但與3h相比差異不顯著(P＜0.05)。因此，選取提取時(shí)間為2h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響Fig.4 Effect of time on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.5 提取pH值對(duì)多酚提取率的影響

圖5 pH值對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響Fig.5 Effect of solvent pH on the extraction efficiency of polyphenols

從圖5可以看出，不同pH值下藍(lán)莓葉多酚提取率存在顯著性差異(P＜0.05)，酸性條件可以破壞多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等的結(jié)合，并且可以降低多酚對(duì)光和氧氣的敏感度，從而提高多酚提取率[17]。pH4時(shí)，藍(lán)莓葉多酚提取率達(dá)到最大值88.57%。

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)多酚提取率的影響

多次提取可以增加藍(lán)莓葉多酚的提取量，但會(huì)對(duì)后續(xù)的分離純化造成一定難度。由圖6可知，2次提取的多酚提取率為89.16%，2、3、4次提取的多酚提取率沒有顯著性差異(P＜0.05)，因此，選擇提取2次作為最佳提取工藝。

圖6 提取次數(shù)對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響Fig.6 Effect of number of extractions on the extraction efficiency of polyphenols

2.2 影響藍(lán)莓葉多酚提取率的顯著因子

使用N＝8的PB試驗(yàn)從6種單因素中篩選出影響藍(lán)莓葉多酚提取率顯著的影響因子，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果如表3所示，運(yùn)用Design Expert軟件，得到藍(lán)莓葉多酚提取率預(yù)測值(Y)的多元一次回歸模型方程為：Y＝ 81.52-0.16X1＋0.09X2-0.04X3＋0.16X4-0.10X5-0.10X6。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Plackett Burman design matrix and results

通過回歸模型的系數(shù)評(píng)估及其顯著性檢驗(yàn)(表4)發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(P＝0.0025)、提取溫度(P＝0.0091)、料液比(P＝0.0236)、提取時(shí)間(P＝0.0156)是影響藍(lán)莓葉多酚提取率的顯著性因素。

表4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)多元回歸模型系數(shù)評(píng)估及其顯著性檢驗(yàn)Table4 Regression coefficients and statistical significance in the fitted regression model based on Plackett Burman design

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與分析

運(yùn)用Design-Expert軟件，對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率顯著影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，得到藍(lán)莓葉多酚提取率(Y)的多元二次回歸模型：

對(duì)上述回歸模型方差分析結(jié)果如表6所示，F(xiàn)檢驗(yàn)顯示回歸模型具有很高的F值(F＝5.61)和很低的P值(P＝0.0013)，說明模型高度顯著。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table5 Box-Behnken experimental design matrix and results

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)的多元回歸模型方差分析Table6 ANOVA for the fitted regression model based on Box-Behnken experimental design

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)多元回歸模型系數(shù)評(píng)估及其顯著性檢驗(yàn)Table7 Regression coefficients and statistical significance in the fitted regression model based on Box-Behnken experimental design

2.4 藍(lán)莓葉多酚提取率響應(yīng)面分析

通過Box-Behnken試驗(yàn)得到的多元二次回歸模型所作的響應(yīng)面圖及其高線圖可用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率影響的兩兩交互作用以及確定各個(gè)因素的最佳水平范圍。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface contour plots showing the effects of ethanol concentration and temperature on the extraction efficiency of polyphenols

圖8 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface contour plots showing the effects of temperature and time on the extraction efficiency of polyphenols

圖7表明，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)、多酚提取率隨著提取溫度的升高而增加，但是溫度過高容易使多酚發(fā)生氧化，從而降低提取率；固定提取溫度，多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增加后減小。圖8表明，增加提取時(shí)間有利于提高多酚提取率，在2.1h時(shí)多酚提取率達(dá)到峰值，再增加提取時(shí)間反而會(huì)減少提取率。圖7與圖8的等高線圖均呈橢圓形，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、提取溫度與提取時(shí)間的交互作用較強(qiáng)，影響顯著。

根據(jù)所建立的模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析，得到多酚提取率最高的參數(shù)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)62.05%、提取溫度67.54℃、料液比1:23.65、提取時(shí)間2.06h，在此條件下多酚提取率預(yù)測值為90.49%。為方便試驗(yàn)將參數(shù)修改為：乙醇體積分?jǐn)?shù)62%、提取溫度68℃、料液比1:24、提取時(shí)間2h。按照上述條件進(jìn)行藍(lán)莓葉多酚提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測藍(lán)莓葉多酚提取率為(89.02±0.02)%，基本和預(yù)測值保持一致。

3 結(jié) 論

3.1 通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各因素最佳值為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度70℃、料液比1:30、提取時(shí)間2h，pH4，提取次數(shù)2次。

3.2 通過PB試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乙醇體積分?jǐn)?shù)(P＝0.0025)、提取溫度(P＝0.0091)、料液比(P＝0.0236)、提取時(shí)間(0.0156)是影響藍(lán)莓葉多酚提取率的顯著性因素。

3.3 利用Box-Behnken試驗(yàn)，得到最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)62.05%，提取溫度67.54℃，料液比1:23.65，提取時(shí)間2.06h。在此條件下，最大提取率為90.49%。其中乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、提取溫度與提取時(shí)間的交互作用明顯。

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Optimization of Extraction Process for Polyphenols from Blueberry Leaves by Response Surface Methodology

FENG Jin1,2，ZENG Xiao-xiong，LI Chun-yang1,*
(1. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agriculture Science, Nanjing 210014, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

This study was designed to optimize the extraction of polyphenols from blueberry leaves using ethanol as the extraction solvent. Four extraction parameters such as ethanol concentration (P = 0.0025), extraction temperature P = 0.0091), solid-to-liquid ratio (P = 0.0236) and extraction time (P = 0.0156) were identified as main variable that influence extraction efficiency through the combined use of one-factor-at-a-time method and Plackett Burman design. The optimum extraction conditions were determined by response surface methodology to be 62.05% ethanol concentration, 67.54 ℃, 1:23.65 solid-to-liquid ratio and 2.06 h. The maximum predicted yield of polyphenols under these conditions was 90.49%, which was close to the measured value. Thus, the fitted quadratic regression model is valid.

polyphenols from blueberry leaves；extraction process；Plakett Burman design；respond surface methodology

Q949.71

A

1002-6630(2013)04-0059-06

2011-11-06

2011年南京市科技發(fā)展計(jì)劃國際聯(lián)合研發(fā)項(xiàng)目(201101093)

馮進(jìn)(1989—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榛钚晕镔|(zhì)提取。E-mail：jaas2010@163.com

*通信作者：李春陽(1966—)，男，副研究員，博士，研究方向?yàn)榛钚晕镔|(zhì)與功能食品。E-mail：lichunyang968@126.com