陳 娟，王昌明，周 燕，黎紅秀

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林541001）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一組多種病因引起的以氣道受損、炎癥因子大量分泌、間充質(zhì)細胞增生和細胞外基質(zhì)異常沉積為特點的漸進性疾病，患者確診后平均生存期僅3～5年［1］。IPF發(fā)病機制不明，近年來國內(nèi)外研究表明肺泡上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺纖維的重要機制之一，細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）可通過活化p38絲裂原活化蛋白激酶類（p38mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）誘導(dǎo) EMT 過程［2］。目前，對IPF尚缺乏有效的治療方法，臨床上常用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，但效果并不滿意。本課題組前期研究表明，青蒿素衍生物青蒿琥酯除抗瘧疾外，還具有抗纖維化作用［3-4］。本研究用青蒿琥酯為工具藥，研究在其干預(yù)下對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 永生化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞（rat lung epithelial-t-antigen negative，RLE-6TN）株購自中南大學湘雅實驗中心細胞庫。TGF-β1購自Peprotech公司（美國）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）粉劑購自sigma公司（美國）；Total RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司；引物由Invitrogen公司設(shè)計合成；組織細胞裂解液（tissue and cell lysis solution，WIP）、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；p38MAPK兔抗人一抗購自Santa cruz（美國）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗人單克隆抗體購自ABBIOTEC公司（美國）；V-波形蛋白（vimentin，Vim）兔抗人一抗購自Bioworld Technology；辣根酶標記山羊抗兔IgG購自中杉金橋；胎牛血清購自GIBCO公司；1640培養(yǎng)基購自HyClone公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RLE-6TN細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代后用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞同步化24h，根據(jù)相關(guān)文獻及預(yù)實驗結(jié)果，誘導(dǎo)劑TGF-β1按說明書配置好母液后稀釋于含1%胎牛血清的培養(yǎng)液中，終濃度為3ng／mL，青蒿琥酯用NaHCO3溶解后再調(diào)整到相應(yīng)終濃度作用于細胞。

1.2.2 細胞分組 MTT粉劑用PBS配成5mg／mL的存儲液，過濾除菌，4℃保存。將細胞分為6組，1個對照組、5個實驗組（其中1個誘導(dǎo)組，4個藥物干預(yù)組）。計數(shù)細胞，3 000個／孔細胞種植96孔板，設(shè)5個復(fù)孔，在1%FBS（對照組）、TGF-β13ng／mL（TGF-β1組）、TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯1 mg／L（TGF-β1聯(lián)合1組）、TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯2mg／L（TGF-β1聯(lián)合2組）、TGF-β13ng／mL＋ 青蒿琥酯 4mg／L（TGF-β1聯(lián)合3組）、TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯8mg／L（TGF-β1聯(lián)合4組）作用細胞24h后加入MTT溶液至終濃度0.5mg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸干凈 MTT溶液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL，避光平搖10min，用酶標儀測定490nm處的吸光度值（A）。根據(jù)抑制率＝﹝（對照組OD490值-實驗組OD490值）／對照組OD490值﹞×100%計算細胞抑制率。用寇式改良法計算IC50，根據(jù)IC50選擇藥物干預(yù)濃度進行以下實驗。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察 當細胞生長融合至60%～80%時，棄培養(yǎng)液，換含1%胎牛血清的1640培養(yǎng)液靜止24h，換新鮮靜止液，于對照組、TGF-β1組及 TGF-β1聯(lián)合1、2、3、4組培養(yǎng)液中分別加入1%FBS、TGF-β13ng／mL及TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯1、2、4、8mg／L作用細胞24h后，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的改變并拍照。

1.2.4 Western blot檢測上皮及間質(zhì)細胞標志物的表達 各組細胞生長、培養(yǎng)同1.2.3，培養(yǎng)細胞24h后用WIP裂解液（1 mL）＋蛋白酶抑制劑（10μL）＋磷酸酶抑制劑（10μL）混合，每皿（d＝10cm）加入 WIP裂解液混合液200μL，冰上裂解45 min，用細胞刮刮下后離心取上清液，BCA蛋白測定試劑盒做標準曲線測定蛋白濃度后，取30μg樣品蛋白進行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，加入一抗，37℃孵育2h，Tris-Buffered-Saline with Tween-20（TBST）洗滌后加辣根酶標記二抗，37℃孵育2h，TBST洗滌后加適量ECL發(fā)光液（ECL luminous liquid）暗室發(fā)光，曝光后在凝膠成像系統(tǒng)下掃描并獲取密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各實驗均重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，差異顯著性分析采用One-way ANOVA分析，組間采用方差分析比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 青蒿琥酯對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細胞增殖的影響TGF-β1作用于RLE-6TN 24h后，細胞較對照組增殖明顯（P＜0.05）；青蒿琥酯不同濃度作用于 TGF-β1誘導(dǎo)的 RLE-6TN 24h后，細胞增殖受到抑制（表1）。根據(jù)抑制率用寇式改良法計算IC50，24hIC50＝8.86mg／L。

2.2 青蒿琥酯對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細胞形態(tài)的影響與對照組比較，加入TGF-β1后，RLE-6TN由鋪路石狀上皮形態(tài)變成梭形、紡錘形，而且其細胞間隙略變大，細胞和細胞之間的連接變得松散。在TGF-β1誘導(dǎo)后再加入青蒿琥酯，即TGF-β1聯(lián)合1、2、3、4組，與 TGF-β1組比較，細胞的梭形結(jié)構(gòu)減少，部分恢復(fù)鋪路石狀上皮形態(tài)，但細胞之間連接仍松散，見圖1。

2.3 青蒿琥酯對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細胞p38MAPK及間質(zhì)細胞標志性蛋白表達的影響 細胞培養(yǎng)24h后，TGF-β1誘導(dǎo)RLE-6TN表達p38MAPK、α-SMA、Vim均較對照組明顯增加（P＜0.05），青蒿琥酯作用于 TGF-β1誘導(dǎo)的 RLE-6TN后，p38MAPK、α-SMA、Vim表達均較 TGF-β1組明顯減少（P＜0.01），且各組間減少呈劑量依賴性（P＜0.05）。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），各組蛋白表達的電泳圖，見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下各組細胞形態(tài)（×100）

表1 各組細胞24h后增殖抑制率比較

圖2 各組蛋白表達的電泳圖

3 討 論

肺間質(zhì)纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是一組多種病因引起的以氣道、肺泡結(jié)構(gòu)排列紊亂，膠原大量沉積為特點的漸進性疾病。臨床表現(xiàn)為刺激性干咳、無痰、進行性的呼吸困難等，最終可以引起呼吸功能衰竭而死亡。目前肺纖維化的病因及其發(fā)病機制尚未完全闡明，但都有其共同規(guī)律，肺部受感染或損傷后，損傷的肺上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的細胞因子，刺激炎癥細胞的聚集、活化，分泌膠原等細胞外基質(zhì)，沉積在肺間質(zhì)，導(dǎo)致肺纖維化［5］。

TGF-β1是一種多效性的細胞因子，是目前肺纖維化的研究熱點和重要藥物作用靶點。TGF-β1可由淋巴細胞、單核細胞、上皮細胞和成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生，通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移、黏附、調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的代謝，參與肺胚胎發(fā)育、組織損傷和修復(fù)［6］。

Furukawa等［7］研究表明，TGF-β1誘導(dǎo)MAPK磷酸化活性變化，通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)人肺上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化。肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cell，AEC）包括Ⅰ和Ⅱ型，肺泡Ⅱ型上皮細胞（typeⅡalveolar epithelial cell or typeⅡpneumocyte，ATⅡ）是一種多功能細胞，對維持肺泡結(jié)構(gòu)和功能有重要意義。它是Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞的祖細胞［8-9］，在正常細胞更新和損傷修復(fù)過程中，ATⅡ可以分化為Ⅰ型細胞，也可通過有絲分裂補充自身的數(shù)量。此外，ATⅡ具有合成和分泌肺表面活性物質(zhì)，維持肺泡內(nèi)外液體平衡，免疫調(diào)節(jié)等作用［10］。

絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（MAPKs）信號通路是真核細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞外信號到細胞內(nèi)引起細胞反應(yīng)的四大信號系統(tǒng)之一，其參與了細胞生長、發(fā)育及細胞間功能同步等多種生理功能，目前已知MAPKs由4個主要成員構(gòu)成，即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （ERK1／ERK2）、應(yīng)激活化蛋白激酶 （SAOK／JNK）、p38MAPK和ERK5。其中p38MAPK與肺纖維化過程密切相關(guān)［11］。TGF-β1誘導(dǎo)活化TGF-β1受體復(fù)合物，級聯(lián)活 化p38MAPK，p38MAPK把信號傳遞到細胞核內(nèi)，活化EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail家族蛋白中的Snail1和Slug表達，從而引起細胞形態(tài)及分泌功能的改變。Snail家族蛋白通過鋅指結(jié)構(gòu)域及N-末端結(jié)構(gòu)域起著轉(zhuǎn)錄抑制子的作用，Snail1在EMT過程中的作用早已有報道［12］。

張新志等［13］用抗纖靈沖劑作用于SD大鼠后，發(fā)現(xiàn)抗纖靈沖劑可通過調(diào)節(jié)TGF-β1／p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮抗腎小管間質(zhì)纖維化效應(yīng)。Matsuoka等［14］研究也證實，用p38MAPK拮抗劑干預(yù)由博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型后纖維化程度明顯減輕，以上資料均顯示p38MAPK的活化與纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

Willis等［15］研究表明Vim是一種中間絲蛋白，是間質(zhì)細胞的典型標記物，α-SMA是一種肌動蛋白，幾乎所有的真核細胞都表達肌動蛋白，常用于標記間質(zhì)細胞。TGF-β1誘導(dǎo)的EMT早期變化就是細胞質(zhì)內(nèi)細胞骨架進行重排，表達新的表型蛋白如α-SMA，細胞質(zhì)內(nèi)肌絲也從上皮型的角蛋白（cytokeratin，CK）轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞的Vim。細胞黏附連接主要成分E-鈣黏蛋白的下調(diào)或丟失，緊密連接成分的下調(diào)，以及間充質(zhì)細胞特異性的蛋白標記，如纖維連接蛋白、Vim和N-鈣黏蛋白的表達上調(diào)已成為人們判斷EMT發(fā)生的重要的分子指標［16］。

青蒿琥酯是抗瘧疾的有效單體，近年來研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯除了有很好的抗瘧作用外，還具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等作用［17］。本課題前期研究表明青蒿琥酯可以抑制人胚肺成纖維細胞增殖、促進其凋亡［3-4］，且呈劑量依賴性。以上的研究結(jié)果為青蒿素防治肺纖維化提供了理論依據(jù)。但是目前國內(nèi)外關(guān)于青蒿琥酯防治肺纖維化的研究報道較少，主要是關(guān)于其對成纖維細胞增殖的抑制作用，而對青蒿琥酯調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的作用機制研究少見報道。

本研究穩(wěn)定傳代ATⅡRLE-6TN后，予TGF-β13ng／mL誘導(dǎo)ATⅡ轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細胞，結(jié)果表明，TGF-β1作用于RLE-6TN 24h后，p38MAPK、α-SMA、Vim蛋白均表達增加（P＜0.05）。可認為TGF-β1成功誘導(dǎo)RLE-6TN轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細胞，其可能機制為活化p38MAPK蛋白。給予不同劑量的青蒿琥酯作用于TGF-β1誘導(dǎo)后的RLE-6TN 24h后，信號蛋白p38MAPK及間質(zhì)細胞標志物α-SMA、Vim蛋白均較TGF-β1組表達明顯減少（P＜0.01），且呈濃度依賴性?？烧J為青蒿琥酯對TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化過程有抑制作用，且隨著青蒿琥酯濃度的增加，這種抑制作用逐漸增強。

綜上所述，TGF-β1能誘導(dǎo)EMT過程。青蒿琥酯具有抗纖維化作用，其可能機制為抑制p38MAPK的活性從而抑制EMT過程。

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