周小林，王 成，申明強，陳 默，賀賜安，王軍平 (第三軍醫(yī)大學:.軍事預防醫(yī)學院防原醫(yī)學教研室，全軍復合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室;2.基礎部外科應用解剖與手術學教研室，重慶400038)

半個多世紀以來抗生素的廣泛使用給臨床感染性 疾病的治療產(chǎn)生了革命性的深遠影響。然而細菌多藥耐藥性的產(chǎn)生，給疾病的治療帶來了極大的困難，逐漸成為了世界性普遍關注和難以解決的問題，新型抗菌藥物的研制迫在眉睫。近年來發(fā)現(xiàn)的防御素，作為機體天然防御系統(tǒng)重要組成部分，廣泛分布于生物體內(nèi)，以其廣譜抗微生物活性和在有效劑量內(nèi)不產(chǎn)生耐藥性的特點備受關注。人α防御素5(human α-defensin 5，HD5)是由35～55個氨基酸組成，分子量只有3～5 kD的富含半胱氨酸殘基的陽離子短肽，主要在人小腸潘氏細胞、生殖道上皮細胞及鼻黏膜細胞分泌表達，對革蘭氏陰性菌、陽性菌、病毒均有較強的殺滅作用［1］。HD5具有特定的空間結(jié)構，廣泛的抗菌活性、細胞毒性和免疫趨化作用［2］。為了進一步的新藥應用的研究，我們選擇了不同藥用輔料進行單因素實驗，為下一步制劑配方的研制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

配制LB培養(yǎng)基所需的胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉等購自英國Oxoid公司，配制緩沖液所使用的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，輔料甘油、蔗糖、NaCL等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。藥用輔料羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、吐溫80、尼泊金甲酯鈉購自生工生物工程(上海)股份有限公司。原始大腸埃希菌(ATCC25922)菌株為本室凍存。多肽由杭州中肽生化有限公司合成(干粉狀)，用滅菌超純水配制，-70℃保存，取用時臨時用超純水配制成需要的濃度。其他設備如超凈臺、-70℃及4℃冰箱、pH計、培養(yǎng)箱、搖床、烘干機等設備均為本室所有。

1.2 方法

1.2.1 HD5抗菌活性檢測 原始大腸埃希菌E.coli菌株活化后，挑單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜約12 h形成種子液。將種子液1∶1 000接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min擴增3 h至菌液OD(600)值為0.5 ～0.6 時取出，低溫(4℃)10 000 r/min 離心5 min。將菌體用緩沖液洗滌2次，再次測定菌液 OD(600)值，并將 OD(600)值調(diào)定為0.5，稀釋100 倍，制成2.5 ×106/mL 的懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔20 μl(總體積50 μl)，加入反應終濃度分別為 25.00、12.50、6.25、3.12 μg/mL 的 HD5 多肽，每個終濃度設置2個復孔，同時設置各濃度輔料未加入HD5作為對照組。37℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)2 h后取出20 μl加入含1%LB液體的緩沖液中稀釋1 000倍，取出100 μl制作LB平板。將平板置于37℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)超過12 h，計數(shù)平板菌落數(shù)，分別計算細菌抑菌率［抑菌率=(1-實驗組平均菌落數(shù)/空白對照組平均菌落數(shù))×100%］。根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)為后續(xù)加入藥用輔料的實驗選擇合適的HD5濃度。

1.2.2 單因素實驗選擇輔料種類及其濃度 根據(jù)輔料對HD5的保護機理以及輔料篩選的一般原則，結(jié)合有關該方面文獻報道和本實驗室對藥用輔料的前期研究，分別選取蔗糖、甘油、NaCl、吐溫80、HP-β-CD、尼泊金甲酯鈉作為單因素考察對象，并以抑菌率為響應值，篩選出HD5的適宜的輔料及其濃度范圍。實驗以各濃度輔料未加HD5為對照組，其中將未添加HD5和輔料的對照組稱為空白對照組，而各濃度輔料加入HD5為實驗組。具體做法是:將菌液稀釋至2.5×106/mL后加入96孔板與12.5 μg/mL HD5和不同濃度的輔料反應后計數(shù)菌落數(shù)，從而計算出抑菌率，方法同前，統(tǒng)計并比較抑菌率。

1.2.3 抑菌率計算公式 實驗組抑菌率=(1-實驗組平均菌落數(shù)/空白對照組平均菌落數(shù))×100%;對照組抑菌率=(1-對照組平均菌落數(shù)/空白對照組平均菌落數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HD5抗菌活性檢測

不同終濃度HD5的抑菌率見圖1，隨著HD5質(zhì)量濃度的增加，抑菌率明顯升高。數(shù)據(jù)提示HD5終濃度為12.50 μg/mL時，其抑菌率在90% ～100%之間，既能達到較好的抑菌效果，又小于最低殺菌濃度，可以很好地反映HD5抗菌活性的量效關系，可將此濃度作為后續(xù)實驗的HD5終濃度。

圖1 不同濃度的HD5的抑菌率

2.2 保濕劑甘油對HD5抗菌活性的影響

本組數(shù)據(jù)顯示，與甘油濃度0組比較，實驗組各濃度輔料的抑菌率均沒有統(tǒng)計學差異，但是對照組抑菌率隨甘油體積濃度變化比較大(圖2)。10%甘油的抑菌率顯著低于其他組，且與甘油濃度0組比較，差異有統(tǒng)計學意義。而加入20%甘油處理時，對照組抑菌率略有下降，差異沒有統(tǒng)計學意義;而40% ～50%甘油處理對照組抑菌率接近于實驗組抑菌率，但由于40%～50%的甘油本身具有顯著的抑菌活性，無法判斷此濃度甘油是否會影響甘油的抑菌活性。因此，可選擇低于10%體積濃度的甘油作為HD5的保濕劑和潤滑劑，這個劑量不會影響到HD5的抗菌效果，又可以避免甘油表現(xiàn)出抑菌活性干擾實驗結(jié)果，40%以上甘油可作為防腐劑使用。

圖2 不同濃度甘油對HD5抑菌率的影響

2.3 穩(wěn)定劑NaCl和蔗糖對HD5抗菌活性的影響

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)顯示(圖3)，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，實驗組和對照組抑菌率均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，說明NaCl可明顯抑制HD5的抗菌活性。與只加HD5組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，因此NaCl不適合作為HD5的穩(wěn)定劑。而終濃度為3%～12%蔗糖的實驗組和對照組比較抑菌率均沒有統(tǒng)計學差異，P ＞0.05。

圖3 加入不同濃度NaCl對HD5抑菌率的影響

2.4 防腐劑尼泊金甲酯鈉對HD5抗菌活性的影響

各濃度尼泊金甲酯鈉加入后，HD5抗菌活性檢測數(shù)據(jù)結(jié)果提示:與只加HD5組比較，質(zhì)量濃度0～1%的尼泊金甲酯鈉的抑菌率無明顯變化，差異沒有統(tǒng)計學意義(圖5)。隨著尼泊金甲酯鈉質(zhì)量濃度的增加，單獨加入尼泊金甲酯鈉的抑菌率呈現(xiàn)上升的趨勢，到1%時抑菌率與單獨加入HD5組抑菌率相同，差異沒有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)提示加入1%尼泊金甲酯鈉的抑菌活性在加和不加HD5是相同的，很難判斷這個濃度的尼泊金甲酯鈉是否影響HD5的抗菌活性，因此此濃度不作備選。根據(jù)防腐劑的使用規(guī)則，盡量選取小劑量的防腐劑，即0.05%尼泊金甲酯鈉可作為HD5防腐劑濃度備選。

圖4 加入不同濃度尼泊金甲酯鈉對HD5抑菌率的影響

2.5 HP-β-CD和吐溫80對HD5抗菌活性的影響

從表面活性劑HP-β-CD的實驗數(shù)據(jù)可以看出:與HP-β-CD濃度0組比較，實驗組10% ～20%HP-β-CD的抑菌率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05(圖5)。而單純加入各濃度HP-β-CD的對照組抑菌率均非常低，但呈現(xiàn)一定的上升趨勢，抑菌率均低于相應濃度的實驗組。因此在選取HP-β-CD作為抗氧化劑時質(zhì)量濃度應控制在5%及以下，以不影響HD5抗菌活性和發(fā)揮HP-β-CD對HD5的抗氧化作用及表面活性劑作用最佳狀態(tài)的基礎上選擇較低濃度。各質(zhì)量濃度吐溫80的實驗組HD5抗菌活性檢測數(shù)據(jù)結(jié)果提示:與吐溫80濃度0組比較，實驗組的抑菌率沒有明顯變化，差異沒有統(tǒng)計學意義。但對照組中0.5%吐溫80的抑菌率明顯低于其他各組，2.5%～10%吐溫80的抑菌率與實驗組比較無顯著差異，無法判斷是否影響了HD5的抗菌活性，因此可將0.5%吐溫80作為HD5的備選輔料濃度，見圖6。

圖5 加入不同濃度HP-β-CD對HD5抑菌率的影響

圖6 加入不同濃度吐溫80對HD5抑菌率的影響

3 討論

隨著分子生物學技術和基因重組技術的發(fā)展，蛋白質(zhì)與多肽類藥物憑借其獨特的優(yōu)勢已逐漸成為一種重要的臨床藥物類型。目前已經(jīng)批準上市的抗菌肽藥物并不多，如多黏菌素和短桿肽菌是最早應用于臨床的抗菌肽制劑，而2003年9月上市，用于治療由金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、鏈球菌以及腸球菌引起的皮膚感染的達托霉素則是一種Ca2+依賴的陰離子多肽藥物［3-4］。HD5作為一種陽離子小分子肽，抗致病微生物種類廣泛、抗菌活性高，但其抗菌機制目前仍然不是很明確，根據(jù)同源抗菌肽推測其機制可能為:HD5吸附到細胞膜上致使膜結(jié)構通透性破壞，胞內(nèi)重要礦物質(zhì)、代謝物及小分子泄漏，致細菌死亡［5］。因此HD5可避免微生物產(chǎn)生耐藥，有望開發(fā)成為新型的抗菌藥物。但由于這類藥物穩(wěn)定性差，半衰期短，人體內(nèi)廣泛存在的各種酶類可以很快使其降解，失去活性［6］。因此HD5在生產(chǎn)、保存、運輸和給藥過程中都容易喪失活性，極大地限制了其在臨床上的廣泛應用。藥用輔料是指在制劑處方設計過程中，為了解決制劑的有效性、穩(wěn)定性、安全性和成型性，加入到主藥中的一切藥物用料的統(tǒng)稱，是藥物制劑生產(chǎn)和發(fā)展的物質(zhì)基礎，在制劑和藥物生產(chǎn)中起著非常關鍵的作用。因此，在HD5制劑中添加各種輔料可起到穩(wěn)定藥物及延長使用期限等作用，這些輔料在有效濃度范圍內(nèi)不影響HD5抗菌活性，使藥物抗菌效果穩(wěn)定，在使用期間內(nèi)避免失活，最好還能與HD5起到協(xié)同抗菌作用。

本實驗結(jié)合相關文獻及對于HD5的前期研究選取了甘油、NaCl、吐溫80、HP-β-CD 等輔料進行了 HD5抗菌活性檢測的單因素實驗，為后期制劑配方的選取提供實驗依據(jù)。文獻報道HD5的體外抗菌濃度在10～100 μg/mL［7］，這個濃度范圍對正常功能的細胞無毒害作用［8-9］。根據(jù)本實驗結(jié)果可知，隨著HD5濃度的降低，HD5的抗菌活性逐漸降低，在不影響實驗結(jié)果的前提下，選擇12.5 μg/mL作為后期輔料篩選的HD5的終濃度。根據(jù)HD5的生物特性，選擇HP-β-CD和吐溫80作為助溶劑和抗氧劑及表面活性劑。由于在制備液體藥劑過程中，防腐措施并不能完全保證無細菌污染，必要時應添加適當?shù)姆栏瘎┮种莆⑸锏纳L繁殖，甚至殺滅微生物，但原則上應不用或少用防腐劑。因此本組選用尼泊金甲酯鈉作為防腐劑被納入實驗。HP-β-CD易溶于水，對許多化合物具有優(yōu)良的包絡作用，可提高包絡物質(zhì)的穩(wěn)定性，在生物體內(nèi)可提高被包絡藥物的釋放速度和生物利用度，對人體無毒，是一種很好的藥物載體［10-11］。根據(jù)中國藥典記述的吐溫80不能與含酚羥基的消毒防腐劑配伍，如吐溫80與尼泊金類、三氯叔丁醇、苯甲醇等聯(lián)用時會導致其抑菌力減低。因此選用尼泊金甲酯鈉作為防腐劑時不宜選用吐溫80作為表面活性劑。甘油是較好的溶劑、保濕劑和潤滑劑，而NaCl和蔗糖分別作為穩(wěn)定劑納入實驗［12］。單因素實驗結(jié)果表明0.29%NaCl和10%以上的HP-β-CD可使HD5的抑菌率明顯下降(P＜0.05)，說明這些輔料對HD5的抗菌活性有影響。且隨著NaCl濃度的增高，HD5的抑菌率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，這與文獻報道的一致［13］。尼泊金甲酯鈉、甘油、吐溫80在設定的濃度范圍內(nèi)實驗組抑菌率無明顯變化，但1%尼泊金甲酯鈉的對照組抑菌率和實驗組相同，此濃度下無法判斷是否影響了HD5的抗菌活性，故此濃度的尼泊金甲酯鈉不適合作為HD5的輔料。另外2.5%及以上的吐溫80、40%及以上的甘油的對照組抑菌率也和實驗組相同，因此這些濃度最好不作為備選輔料。由于較高濃度的吐溫80、甘油和尼泊金甲酯鈉本身具有顯著抑菌活性，因此在這些濃度范圍內(nèi)即使不加HD5，抑菌率也很高［14］，很難判斷這種情況下HD5的活性有沒有受到影響，因此后期在選取這些輔料濃度時要注意區(qū)分二者的抑菌作用的主次關系。另有文獻報道，NaCl在5%以下即可對大腸桿菌起到抑制作用，因此如果繼續(xù)加大NaCl用量也可能起到抑菌作用，但這個作用可能不是HD5所賦予的，要注意區(qū)分［15］。

由于HD5是小分子物質(zhì)，有不穩(wěn)定、易被酶類分解等特性，用藥方式還是以局部應用為主，主要通過皮膚、黏膜等給藥，而系統(tǒng)用藥比較少見。因此劑型主要是以外用和局部系統(tǒng)給藥為主，如膏劑、噴霧劑、洗液等。在HD5中加入適當?shù)乃幱幂o料是藥物制劑的必要步驟，也是藥物研究非常重要的一個環(huán)節(jié)。

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