向 穎，林 輝，胡代玉，劉 潔，沈 靜，吳 龍，李至偉，熊鴻燕 (.第三軍醫(yī)大學(xué)軍隊(duì)流行病學(xué)教研室，重慶40008;.重慶市結(jié)核病防治所，重慶400050;.解放軍785部隊(duì)門診部，四川雅安65000)

結(jié)核病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸與傳統(tǒng)環(huán)境因素及宿主遺傳因素密切相關(guān)，且這些因素之間存在復(fù)雜的交互作用，但關(guān)于兩者在結(jié)核病發(fā)生中的交互作用研究報(bào)道極少。維生素D受體(VDR)基因和SP110基因均可影響結(jié)核桿菌感染免疫及產(chǎn)生組織學(xué)應(yīng)答最主要的效應(yīng)細(xì)胞巨噬細(xì)胞的功能和活性，從而影響結(jié)核分支桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活、生長及感染后的轉(zhuǎn)歸等。大量流行病學(xué)研究證實(shí) VDR 基因(TaqI、FokI)［1-3］、SP110基因(rs1135791、rs722555)SNPs多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān)［4-6］。本研究以重慶地區(qū)人群為研究對象，采用病例對照研究方法探討SP110、VDR基因的多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系及基因間、基因與傳統(tǒng)環(huán)境間的交互作用，為進(jìn)一步理解結(jié)核病病因等提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

病例組:2010年4月至2011年4月，按照《中國結(jié)核病分類法》診斷標(biāo)準(zhǔn)，從重慶市結(jié)核病防治所和沙坪壩區(qū)結(jié)核病防治中心連續(xù)收集新確診的漢族肺結(jié)核病患者198例組成病例組，排除伴有HIV感染、糖尿病、腫瘤、慢性肺炎等其他疾病的患者。對照組:要求與病例組的年齡和性別成組匹配，從某三甲醫(yī)院獻(xiàn)血中心和體檢中心同期體檢的人群中選擇健康的人群(胸透正常，PPD試驗(yàn)陰性)共195人作為對照組。

1.2 調(diào)查主要方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇與結(jié)核病主要相關(guān)因素進(jìn)行調(diào)查，如年齡、性別、家庭收入、煙草暴露、卡介苗接種史等。采用面對面詢問的方式填寫調(diào)查表。

1.2.2 DNA提取 利用全血基因組提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取檸檬酸鈉抗凝靜脈血5基因組DNA，-30°保存?zhèn)錂z。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測 選擇與結(jié)核病聯(lián)系相對穩(wěn)定的VDR 基因(TaqI、FokI)和 SP110 基因(rs1135791、rs722555)作為交互作用分析位點(diǎn)。依據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html)信息，設(shè)計(jì)并合成PCR擴(kuò)增引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，見表1。由江蘇為真生物醫(yī)藥科技有限公司采用高分辨率溶解曲線技術(shù)(high resolution melt，HRM)進(jìn)行多態(tài)性檢測，并采用DNA測序進(jìn)行分型確認(rèn)。結(jié)合基因型分型圖和DNA測序結(jié)果判斷基因型。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析。分別采用單因素分析和多因素非條件logistic回歸分析進(jìn)行相關(guān)性和交互作用分析，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

表1 VDR和SP110基因多態(tài)性PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 研究對象及一般情況

分別收集215名肺結(jié)核病病例和對照，其中病例組198名和對照組195名完成HRM檢測納入分析，據(jù)樣本含量公式估算，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)最低樣本量要求(180例)。2組的年齡和性別構(gòu)成無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 主要環(huán)境因素與結(jié)核病相關(guān)性分析

傳統(tǒng)環(huán)境因素與結(jié)核病相關(guān)性的單因素分析結(jié)果證實(shí)結(jié)核病患者接觸史、吸煙、人居平均面積、人均年收入、居室通風(fēng)、工作強(qiáng)度等與結(jié)核病發(fā)生有關(guān)［7］。

2.3 VDR和SP110基因多態(tài)性與結(jié)核病相關(guān)性分析

2.3.1 Hardy-Weinberg平衡分析 對照組中VDR基因(FokI、TaqI)和SP110基因(rs1135791、rs722555)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布頻率與Hardey-Weinberg平衡的理論頻數(shù)之間沒有顯著性差異(P＞0.05)，見表2，表明所選擇的對照人群符合遺傳平衡狀態(tài)，基因型分布均勻，可以進(jìn)行下一步分析。

2.3.2 基因多態(tài)性與結(jié)核病的相關(guān)性 由表3可見，病例組與對照相比，病例組中VDR基因FokI-ff基因型的分布頻率(22.2%)顯著高于對照組的該基因型分布(13.3%)，P ＜0.05;以FokI-FF為參照計(jì)算OR及95%CI值均大于1。未發(fā)現(xiàn)TaqI基因多態(tài)性與結(jié)核病明顯的相關(guān)性。

病例組與對照相比，rs722555基因型G/G、rs1135791基因型C/T的分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＜0.05)，且以對應(yīng)的野生型為參照的OR值及OR95%CI值下限均大于1。

2.3.3 傳統(tǒng)因素與基因的交互作用分析 選擇單因素分析中與結(jié)核病相關(guān)的傳統(tǒng)因素和基因位點(diǎn)進(jìn)行多因素非條件logistic回歸分析，以了解它們在結(jié)核病發(fā)生中的作用。由表4可見，結(jié)核病患者接觸史、吸煙、FokI-ff和rs722555基因型G/G進(jìn)入回歸模型，OR及OR95%CI與因素單獨(dú)存在時(shí)有明顯差異。再將這些因素分別組合為一獨(dú)立因素，再次進(jìn)行多因素logistic回歸分析，以判斷它們間交互作用。其中同時(shí)具備FokI-ff與吸煙、結(jié)核病患者接觸史的人群發(fā)生結(jié)核病的危險(xiǎn)性明顯高于這3個(gè)因素單獨(dú)時(shí)的危險(xiǎn)性。

3 討論

研究證實(shí)結(jié)核病的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸與傳統(tǒng)環(huán)境因素(如吸煙、居住環(huán)境、接觸史等)和宿主遺傳易感基因(如VDR［1-3］、HLA［8］、NRAMP1［3］、SP110［4-6］等)等因素共同作用密切相關(guān)，但關(guān)于傳統(tǒng)環(huán)境因素與易感基因在結(jié)核病發(fā)生中的交互作用研究報(bào)道較少。其中SP110基因和VDR基因分別位于2q37.1，12q13-q14，其編碼產(chǎn)物均可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞生物活性，影響結(jié)核分枝桿菌在其內(nèi)的生長繁殖，而與結(jié)核病易感性相關(guān)［9-10］，這已被國內(nèi)外大量流行病學(xué)研究分別證實(shí)。本研究選擇文獻(xiàn)報(bào)道與結(jié)核病聯(lián)系相對穩(wěn)定的VDR基因(TaqI、FokI)和SP110基因(rs1135791、rs722555)作為驗(yàn)證和后續(xù)交互作用分析位點(diǎn)，以進(jìn)一步探討基因與基因、基因與傳統(tǒng)環(huán)境因素的交互作用。本研究的樣本量符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，同時(shí)對照組基因多態(tài)性分布符合遺傳平衡狀態(tài)，其結(jié)果可為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)本研究地區(qū)結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

表2 VDR、SP110基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表3 VDR基因FokI、TaqI位點(diǎn)基因型的組間分布及關(guān)聯(lián)分析

表4 環(huán)境因素和基因多態(tài)性在結(jié)核病發(fā)生中的多因素非條件logistic回歸分析

VDR基因FokI-ff基因型導(dǎo)致VDR基因功能第1個(gè)起始密碼子ATG突變?yōu)锳CT，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和其翻譯氨基酸增加，從而影響VDR受體活性，而與結(jié)核病易感性相關(guān)。本研究(表3)與 Singh［3］和 Merza［11］等均發(fā)現(xiàn)VDR FokI-ff與肺結(jié)核易感性相關(guān)。但與Sharma等［2］報(bào)道結(jié)果相左。本研究及周丹等［4］均發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)SP110 rs722555和rs1135791單核苷酸多態(tài)性和肺結(jié)核易感性存在相關(guān)，且與JeVrey等［12］分別以南非、俄羅斯、西非為研究對象的OR95%CI接近。但Xun等［13］納入共6篇關(guān)于SP110基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的病例對照研究進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)，結(jié)果提示SP110基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān)性不強(qiáng)。這些研究進(jìn)一步提示基因多態(tài)性與結(jié)核病的相關(guān)性存在明顯地區(qū)和人群差異。因此，以不同人群為研究對象開展相關(guān)研究對于闡明結(jié)核病遺傳相關(guān)性有重要意義。

多因素logistic回歸分析結(jié)果(表4)顯示，結(jié)核病患者接觸史、吸煙、FokI-ff和rs722555基因型G/G進(jìn)入回歸模型，其中同時(shí)具備FokI-ff與吸煙、結(jié)核病患者接觸史的人群以及同時(shí)具備吸煙、FokI-ff與rs722555-G/G人群發(fā)生結(jié)核病的危險(xiǎn)性明顯高于各個(gè)因素獨(dú)立時(shí)的危險(xiǎn)性，提示基因與環(huán)境、基因間存在一定正交互作用。

由于本研究納入研究的樣本量相對較小，難以進(jìn)行分層分析，在一定程度上限制了傳統(tǒng)因素與基因、基因與基因間的交互作用判斷，同時(shí)與結(jié)核病發(fā)生相關(guān)傳統(tǒng)環(huán)境因素、易感基因眾多，有待擴(kuò)大樣本量和選擇更多易感基因、環(huán)境因素進(jìn)行深入系統(tǒng)地研究，為闡明結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

［1］Su Qian，Ma Xiangyu，Lin Hui，et al.Association between gene polymorphisms of vitamin D receptor and pulmonary tuberculosis susceptibility:a meta-analysis［J］.Journal of Medical Colleges of PLA，2011，26(2):63-75.

［2］ Sharma PR，Singh S，Jena M，et al.Coding and non-coding polymorphisms in VDR gene and susceptibility to pulmonary tuberculosis in tribes，castes and Muslims of Central India［J］.Infect Genet Evol，2011，11(6):1456-1461.

［3］Singh A，Gaughan JP，Kashyap VK，et al.SLC11A1 and VDR gene variants and susceptibility to tuberculosis and disease progression in East India［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2011，15(11):1468-1474.

［4］周 丹，陶 楊，蔡家春，等.Sp110基因rs1135791、rs722555多態(tài)性與結(jié)核病的相關(guān)性研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35(3):416-419.

［5］Liang L，Zhao YL，Yue J，et al.Association of SP110 gene polymorphisms with susceptibility to tuberculosis in a Chinese population［J］.Infect Genet Evol，2011，11(5):934-939.

［6］Tosh K，Campbell SJ，F(xiàn)ielding K，et al.Variants in the SP110 gene are associated with genetic susceptibility to tuberculosis in West Africa［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(27):10364-10368.

［7］蘇 倩，向 穎，胡代玉，等.VDR基因多態(tài)性、環(huán)境因素與重慶肺結(jié)核病的聯(lián)系及交互作用研究［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2012，21(4):361-364.

［8］Duarte R，Carvalho C，Pereira C，et al.HLA class II alleles as markers of tuberculosis susceptibility and resistance［J］.Rev Port Pneumol，2011，17(1):15-19.

［9］Lewis SJ，Baker I，Davey Smith G.Meta-analysis of vitamin D receptor polymorphisms and pulmonary tuberculosis risk［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2005，9(10):1174-1177.

［10］周 丹.核體蛋白Sp110及其生物學(xué)功能［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2006，3(4):271-274.

［11］Merza M，F(xiàn)arnia P，Anoosheh S，et al.The NRAMPI，VDR and TNF-alpha gene polymorphisms in Iranian tuberculosis patients:the study on host susceptibility［J］.Braz J Infect Dis，2009，13(4):252-256.

［12］JeVrey S，Szeszko.Barry Healy，Helen Stevens，et al.Resequencing and association analysis of the SP110 gene in adult pulmonary tuberculosis［J］.Hum Genet，2007，21(2):155-160.

［13］Xun Lei，Hang Zhu，Lang Zha，et al.SP110 gene polymorphisms and tuberculosis susceptibility:A systematic reviewand meta-analysis based on 10 624 subjects［J］.Infect Genet Evol，2012，2(7):1473-1480.