曲義坤，徐 劍，張英海，劉偉新 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，黑龍江佳木斯154002)

胃癌是一種常見的消化道腫瘤，也是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，并且有逐漸上升趨勢，日益年輕化。浸潤轉(zhuǎn)移是腫瘤的最重要惡性特征之一，是胃癌治療失敗導(dǎo)致死亡的主要原因［1］。本課題應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測胃黏液癌組織和癌旁組織中RAB5A的表達(dá)水平，并觀察它們與臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討各指標(biāo)在胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用，為胃癌的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2010年12月至2012年12月手術(shù)切除胃黏液腺癌標(biāo)本60例以及22例正常胃黏膜組織。所有組織均經(jīng)HE染色病理證實。60例患者中男46例，女36例，年齡25～82歲，平均年齡54.82歲，術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及藥物治療等抗腫瘤措施。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 組織經(jīng)10%中性甲醛固定，蠟塊4 μm連續(xù)切片，貼于預(yù)先涂有APES的載波片上，撈片后置烤箱58～60℃，30～60 min以使切片緊密粘附，備用;置入枸櫞酸鹽緩沖液中加熱抗原修復(fù);加3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;PBS沖洗3次，每次5 min;滴加10%山羊血清室溫封閉20 min;復(fù)溫后PBS沖洗3次，每次5 min;加二抗37℃恒溫水浴箱下孵育20 min;PBS沖洗3次，每次5 min;加酶標(biāo)SABC，室溫下孵育30 min;PBS沖洗3次，每次5 min;加新配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色;自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗返藍(lán);梯度酒精脫水干燥，中性樹脂封片。

1.2.2 RAB5A蛋白過表達(dá)測定 RAB5A免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞為棕黃色，主要存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。免疫組化結(jié)果采用半定量記分法判定［2］，按陽性著色程度評分:0分為無著色，與背景色一致;1分為淺黃色，略高于背景色;2分為棕黃色，明顯高于背景色;3分為棕褐色。按陽性細(xì)胞所占比例評分:0分為陰性;1分為小于10%;2分為11% ～50%;3分為51% ～75%;4分為大于75%。兩者乘積判定陽性結(jié)果:0～2分為陰性(-);3～4分為弱陽性(+);5～8分為中度陽性(++);9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗或者Fisher確切概率檢驗，相關(guān)性檢驗采取Spearman秩相關(guān)分析法，顯著性水準(zhǔn)取0.05。

2 結(jié)果

2.1 在胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織的表達(dá)

RAB5A陽性染色主要被定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜上，鏡下呈黃色或黃褐色顆粒，陽性表達(dá)結(jié)果見圖1。42例胃黏液腺癌組織中RAB5A(+)14例，RAB5A(++)22例，陽性表達(dá)率為85.8%;18例印戒細(xì)胞癌組織中RAB5A(+)7例，RAB5A(++)10例，陽性表達(dá)率為94.4%;60例癌旁組中有10例表達(dá)均呈弱陽性，RAB5A的陽性表達(dá)率為11.2%。癌旁組織中少見陽性表達(dá)，主要表現(xiàn)為輕度不典型增生上皮;22例正常黏膜組織中無RAB5A陽性表達(dá)。RAB5A在胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織的表達(dá)實驗結(jié)果見表1。

圖1 胃癌組織中RAB5A的表達(dá)(SABC×200)

表1 RAB5A在胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織的表達(dá)

2.2 在胃黏液癌的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

通過對患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腹膜種植情況進(jìn)行綜合評價得出RAB5A蛋白陽性表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系，見表2。在胃黏液癌中RAB5A的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小均無關(guān)(P＞0.05)，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腹膜種植情況與RAB5A蛋白的表達(dá)有著密切的關(guān)系。侵及漿膜組織，RAB5A蛋白的陽性表達(dá)率為96.7%，而未及漿膜組織57.1%，兩者之間比較有極顯著性差異(P＜0.01);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移RAB5A蛋白的陽性表達(dá)率為90.9%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移RAB5A蛋白的陽性表達(dá)率為63.7%，兩者比較有極顯著性差異(P＜0.01);有腹膜種植情況RAB5A蛋白的陽性表達(dá)率為86.2%，無腹膜種植情況RAB5A蛋白的陽性表達(dá)率為70.9%，兩者比較有顯著性差異(P＜0.05)

表2 RAB5A在胃黏液癌的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

近年來，胃癌的發(fā)病率逐年遞增。針對胃癌的研究逐漸增多，包括早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與術(shù)式關(guān)系的選擇及中藥在腫瘤方面的應(yīng)用等［3-4］;也有腹腔鏡下進(jìn)展期胃癌的治療［5］;針對基礎(chǔ)性研究也很多，如CD105在胃癌中的表達(dá)［6］等，而早期診斷尤為重要，目前還沒有特異指標(biāo)。RAB5A是重要的蛋白質(zhì)，RAB5A基因定位于人類染色體3p24～24之間，其編碼蛋白是RAB家族的成員之一，是蛋白質(zhì)跨膜運輸通路的信號調(diào)控者［7］。李鈺等［8］發(fā)現(xiàn) RAB5A基因在具有高轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973中高表達(dá)，在其低轉(zhuǎn)移潛能的母系A(chǔ)GZY83-a中低表達(dá)，是一個肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。在體內(nèi)的細(xì)胞膜，質(zhì)膜運輸和GDP/GTP周期的關(guān)鍵調(diào)控因子的功能所涉及的細(xì)胞在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的運輸中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［9-10］，可引起細(xì)胞生長調(diào)控紊亂，無限生長、增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變。RAB5A基因的突變，使細(xì)胞生長調(diào)控紊亂，無限繁殖，并且RAB5A也可以使粘附分子受體下調(diào)，從而可以使細(xì)胞間的粘附力降低，從而導(dǎo)致了腫瘤的轉(zhuǎn)移過程［11］。本實驗表明RAB5A在正常胃黏膜組織、胃癌和癌旁組織中的陽性表達(dá)率為0%、85.8%和11.2%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，可以推斷出胃黏液腺癌的發(fā)生、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及腹膜種植情況可能與RAB5A的表達(dá)增加有關(guān)。實驗結(jié)果表明RAB5A在胃黏液癌和印戒細(xì)胞癌中表達(dá)有明顯差異，印戒細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于胃黏液癌，說明RAB5A也可能是腫瘤分化差的重要標(biāo)志。RAB5A在未侵及漿膜的胃黏液癌中的表達(dá)明顯低于浸潤到漿膜層的表達(dá)，提示 RAB5A可能與腫瘤的浸潤深度有關(guān)。RAB5A在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示RAB5A也可能是腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的標(biāo)志。

本組實驗發(fā)現(xiàn)RAB5A蛋白的表達(dá)與胃癌的病理分型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期均存在明顯相關(guān)性。而在臨床中胃癌患者腫瘤的組織類型、臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移恰恰是決定患者總體生存期 (overall survival，OS)的重要因素。因此RAB5A的陽性表達(dá)與胃癌預(yù)后較差成正相關(guān)性。

綜上所述，RAB5A參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展，同時它們的過量表達(dá)與胃黏液癌的侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，檢測RAB5A在胃癌組織的表達(dá)對評估胃黏液癌浸潤轉(zhuǎn)移風(fēng)險具有重要意義，可作為估計胃癌預(yù)后的參考指標(biāo)。

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