申愛娟， 陳 松， 周曉嬰， 戚存扣

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇 南京210095;2.國家油料作物改良中心南京油菜分中心，江蘇 南京210014;3.農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014)

油料作物種子中多含有油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸［1］。油酸(C18∶ 1)屬單不飽和脂肪酸，它能夠降低人體血液中低密度脂蛋白質(zhì)含量，降低心血管疾病發(fā)病幾率。同時(shí)油酸的化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于多不飽和脂肪酸如亞油酸和亞麻酸，因此，高油酸植物油已被認(rèn)為是氫化植物油的理想替代品［2-3］。目前，提高油料作物種子中的油酸含量，降低多不飽和脂肪酸含量已成為油料作物品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一［4-7］。

據(jù)報(bào)道植物高油酸種質(zhì)主要通過誘變育種和基因工程育種兩條途徑實(shí)現(xiàn)。一是對油菜種子或小孢子進(jìn)行化學(xué)誘變［8-9］，或物理誘變［10］，選擇高油酸含量突變體，并應(yīng)用系統(tǒng)選育與雜交育種技術(shù)獲得高油酸含量油菜材料。二是利用共抑制(Co-suppression)［11］、反義RNA［5］或RNAi 基因沉默［4，12］等基因工程技術(shù)，特異性抑制油菜種子中fad2 基因表達(dá)，阻礙油酸進(jìn)一步脫氫生成亞油酸，而獲得高油酸含量的甘藍(lán)型油菜種質(zhì)。

已有報(bào)道，應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+多基因的多世代聯(lián)合分析方法，對甘藍(lán)型油菜高油酸與低油酸組合后代群體油酸含量進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果顯示，油酸含量受2 對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因控制遺傳［13-15］，并以主基因遺傳為主;控制油酸含量的基因效應(yīng)以加性和上位性效應(yīng)為主，顯性效應(yīng)較小，沒有細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)［13-15］。對誘變獲得的甘藍(lán)型油菜高油酸性狀的遺傳研究結(jié)果表明，高油酸性狀的遺傳受1 對主基因和多個(gè)微效多基因控制［16］。有關(guān)甘藍(lán)型油菜高油酸性狀遺傳的結(jié)果不盡相同，而且試驗(yàn)材料多為誘變或系統(tǒng)選育獲得的高油酸材料，而對轉(zhuǎn)基因獲得的高油酸材料的油酸含量的遺傳規(guī)律鮮有報(bào)道。

W-4 是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得的轉(zhuǎn)基因高油酸甘藍(lán)型油菜品系［12］。分子檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜品系W-4 只含有一個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝［17］。有文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)低(1 或2 個(gè))往往有較好的表達(dá)［18］，有利于育種上應(yīng)用。為了明確W-4 高油酸性狀的遺傳特性，以便更好地將其應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜高油酸育種計(jì)劃，本試驗(yàn)對轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜高油酸品系W-4 與野生型親本W(wǎng)estar 雜交后代群體油酸含量進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因品系W-4 和Westar 均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油菜研究室提供。2009 年秋季，在人工隔離網(wǎng)室內(nèi)種植W-4(P1)和Westar(P2)2 個(gè)親本。2010 年，于油菜開花期人工配置正、反交組合P1× P2(F1)、P2×P1(RF1)，獲得正交F1和反交RF1種子。2010 年秋季在人工隔離網(wǎng)室內(nèi)種植P1、P2、F1、RF1。2011 年花期人工配置回交組合:B1(F1×P1)、B2(F1×P2);RB1(RF1×P1)、RB2(RF1×P2)。植株成熟時(shí)獲得親本P1、P2、F2、RF2及與雙親回交組合B1、B2、RB1和RB2種子。2011 年秋在人工隔離網(wǎng)室進(jìn)行播種，用于苗期Kan 檢測。

1.2 方法

1.2.1 種子脂肪酸組成測定 油菜種子的脂肪酸組成受胚基因型控制。因此種子脂肪酸組成分析直接隨機(jī)選取當(dāng)代成熟種子進(jìn)行。其中親本P1、P2各取10 粒、F2和RF2各取200 粒，其他世代群體分別取100 粒。種子脂肪酸含量在Agilent 6890-GC 氣相色譜儀上進(jìn)行定量檢測。測定方法參照GB/T 17376-2008［19］。

油酸含量分級參照Schietholt 等［16］分級方法:以親本W(wǎng)estar 種子中油酸含量為基礎(chǔ)，當(dāng)種子油酸含量≥Westar+2 倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)時(shí)的個(gè)體為高油酸，種子油酸含量≤Westar+2 倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為低油酸。

1.2.2 油菜幼苗Kan 抗性檢測 當(dāng)幼苗長至3 ～4片真葉時(shí)，用1 g/L Kan 液噴灑植株，10 d 后調(diào)查抗性反應(yīng)。葉片出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)的植株為Kan 敏感型植株，葉片無黃斑的植株為Kan 抗性植株。

1.2.3 適合度測定 對正反交各世代群體高油酸與低油酸含量分離比進(jìn)行適合性卡方(χ2)測驗(yàn)。

式中O 為實(shí)測值，E 為預(yù)期值。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因油菜W-4 和野生型Westar 不飽和脂肪酸含量的比較

轉(zhuǎn)基因油菜種子中不飽和脂肪酸含量測定結(jié)果(圖1)顯示，W-4 種子中油酸含量為(85.10 ±0.73)%，亞油酸和亞麻酸含量分別為(3.47 ±1.60)%和(3.38 ±0.54)%;Westar 種子中油酸含量為(62.16 ±3.68)%，亞油酸和亞麻酸含量分別為(19.17 ±2.20)%和(7.08 ±0.89)%。

W-4 種子中油酸含量比野生型親本W(wǎng)estar 高22.94 個(gè)百分點(diǎn)，而亞油酸、亞麻酸含量分別比Westar 下降15.70 和3.70 個(gè)百分點(diǎn)。這與轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜品系W-4 種子中表達(dá)了油酸脫飽和酶(fad2)基因的反向重復(fù)序列及誘導(dǎo)了fad2 基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默有關(guān)［20］。

圖1 轉(zhuǎn)基因油菜W-4 和野生型Westar 種子中不飽和脂肪酸含量Fig.1 Unsaturated fatty acid contents in the seeds of transgenic oilseed rap W-4 and wild type Westar

2.2 正反交F1 種子中油酸含量

正反交(F1、RF1)種子脂肪酸含量測定結(jié)果顯示，F(xiàn)1油酸含量為(77.55 ±1.30)%，RF1油酸含量為(77.34 ± 2.46 )%，均 高 于 雙 親 中 間 值(73.63%)，與高油酸親本W(wǎng)-4 值接近。表明，W-4高油酸性狀為顯性性狀，無明顯的細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)。

2.3 F2 代和回交后代種子中油酸含量

F2、RF2、B1、RB1、B2和RB2世代群體油酸含量結(jié)果(表1)顯示，F(xiàn)2群體中144 個(gè)個(gè)體表現(xiàn)為高油酸含量(≥69.50%)，56 個(gè)個(gè)體表現(xiàn)為低油酸含量(＜69.50%);RF2群體148 個(gè)個(gè)體表現(xiàn)為高油酸含量，52 個(gè)表現(xiàn)為低油酸含量，經(jīng)檢驗(yàn)F2和RF2群體均符合3∶ 1 分離(χ2=0.96，χ2=0.11);B2、RB2高油酸與低油酸含量個(gè)體呈1∶ 1 分離(χ2=1.0，χ2=0.16)。B1、RB1群體所有個(gè)體均表現(xiàn)為高油酸含量。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因高油酸性狀受1 對顯性基因控制遺傳。

表1 F2、RF2、B1、RB1、B2和RB2世代群體的油酸含量Table 1 The oleic acid contents in the seeds of generations F2，RF2，B1，RB1，B2 and RB2

2.4 Kan 抗性檢測

各個(gè)世代群體苗期Kan 抗性檢測結(jié)果(表2)顯示，P1(W-4)、F1、RF1、B1、RB1群體植株對Kan 反應(yīng)均表現(xiàn)為抗性;而P2(Westar)群體植株對Kan 反應(yīng)均表現(xiàn)為敏感;與Westar 回交世代B2、RB2群體植株對Kan 反應(yīng)表現(xiàn)分離，抗、感比分別為47∶ 39 和48∶ 42，均呈1∶ 1 分離，F(xiàn)2、RF2群體植株間對Kan反應(yīng)的抗、感比均呈3∶ 1 分離。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因油菜W-4 的Kan 抗性受1 對顯性基因控制。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因油菜W-4 基因組中含有1 個(gè)拷貝的卡那霉素抗性基因，與轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)分析結(jié)果一致［17］。

表2 各個(gè)世代群體苗期Kan 抗性反應(yīng)Table 2 Resistance of seedling of each population to kanamycin

3 討論

油菜種子中油酸含量的遺傳一直是油菜品質(zhì)性狀研究的熱點(diǎn)之一。Schietholt 等對甘藍(lán)型油菜高油酸突變體油酸含量遺傳分析發(fā)現(xiàn)，高油酸性狀是由2 個(gè)位點(diǎn)的突變所致，其中一個(gè)位點(diǎn)HO1 主要在種子中表達(dá)，所有突變被認(rèn)為是該位點(diǎn)的等位基因;另一個(gè)突變位點(diǎn)HO2，既增加種子中油酸含量，也提高葉片和根中油酸含量，這2 個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出加性效應(yīng)，并觀察到不顯著的顯性效應(yīng)，無上位效應(yīng)和母性效應(yīng)［16］。索文龍等、張潔夫等應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+多基因多世代聯(lián)合分析法，對油酸含量分別為65.33%和10.91%的甘藍(lán)型油菜雜交組合的油酸含量進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明油酸含量受2 對加性-顯性-上位性主基因+加性顯性上位性多基因控制，基因效應(yīng)以加性效應(yīng)為主，顯性效應(yīng)較小［13-14］。費(fèi)維新等對低油酸與高油酸突變體的雜交后代F1、RF1、B1、RB1、B2、RB2、F2和RF2的高油酸性狀進(jìn)行了數(shù)量性狀遺傳分析，認(rèn)為高油酸性狀由2 對主效基因控制，其狹義遺傳力為63.16%，正反交試驗(yàn)表明，高油酸的遺傳沒有細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)［15］。然而，官梅等以高油酸突變體與常規(guī)低芥酸油菜為材料，研究油菜油酸含量的遺傳，結(jié)果顯示油菜油酸性狀屬數(shù)量性狀，雜種1 代表現(xiàn)為中間類型，并受母本影響，支配油酸性狀的基因數(shù)為1 對主基因，油酸含量遺傳力為69.00% ～71.00%，并表現(xiàn)出對環(huán)境敏感［21］。有關(guān)甘藍(lán)型油菜油酸含量的遺傳結(jié)果不盡相同，這可能與試驗(yàn)材料的不同有關(guān)。

然而，對轉(zhuǎn)基因獲得的高油酸油菜油酸含量的遺傳特點(diǎn)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)材料高油酸油菜品系W-4 是利用RNAi 基因沉默技術(shù)獲得的高油酸油菜新種質(zhì)。W-4 的fad2 基因的反向重復(fù)序列是在油菜napin 啟動(dòng)子控制下表達(dá)的。有研究顯示該啟動(dòng)子在開花后21 d 的種胚中開始表達(dá)［20，22］，理論上功能正常的napin 啟動(dòng)子控制的性狀應(yīng)表現(xiàn)為顯性性狀。本研究以高油酸油菜品系W-4 與其野生型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誛estar 雜交獲得的衍生世代為材料，分析各世代單株種子中油酸含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因油菜W-4 高油酸性狀受1 對顯性基因控制，無明顯的細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng);此外通過對各世代植株對卡那霉素抗性分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因油菜W-4 對卡那霉素的抗性也受1 對顯性基因控制。這些結(jié)果與陳松等［7］對轉(zhuǎn)基因油菜W-4 的T-DNA 拷貝數(shù)的分析結(jié)果一致;核酸雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)-4 整合了一個(gè)拷貝的T-DNA［18］。當(dāng)外源基因以單拷貝方式插入染色體的某一位點(diǎn)時(shí)，整合的外源基因拷貝可作為一個(gè)獨(dú)立的遺傳單位共同分離，即表現(xiàn)孟德爾遺傳。綜合多方面的數(shù)據(jù)可認(rèn)為W-4 的高油酸性狀受1對顯性單基因控制遺傳，這正是W-4 高油酸性狀能夠穩(wěn)定遺傳的基礎(chǔ)。結(jié)合應(yīng)用Kan 檢測，W-4 的高油酸性狀更容易整合到育種材料中，使得高油酸品種(系)篩選更加簡單易行?？梢奧-4 作為一個(gè)高油酸新種質(zhì)，在油菜高油酸育種上的應(yīng)用前景十分廣闊。

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