何 丹，孫 玉 梅，欒 靜，楊 豐 旭

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

酵母菌廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)。在發(fā)酵過程中，酵母菌的代謝活動不斷改變著其所處環(huán)境，導(dǎo)致細胞暴露在諸如熱、氧化、滲透壓、酒精濃度等各種壓力條件下［1］，從而降低細胞的增長速率，影響細胞的活性。為保證發(fā)酵的繼續(xù)進行，酵母細胞不僅要感應(yīng)這些壓力，而且還要迅速做出反應(yīng)，并最終適應(yīng)，以保持其代謝活性［2］。

在果酒釀造過程中，酵母面臨的主要壓力是滲透壓和酒精。發(fā)酵早期較高濃度的糖使?jié)B透壓升高，細胞受高滲刺激而迅速排出水分，出現(xiàn)收縮現(xiàn)象［3］。發(fā)酵后期積累的酒精能夠抑制細胞的生長和活性，影響糖和氨基酸等幾個運輸途徑［4］。果酒釀造過程中的主要揮發(fā)酸——乙酸也能影響酵母菌的生長及新陳代謝。體積分數(shù)為0.05%～0.1%乙酸可以降低細胞生長速率、糖消耗速率和乙醇產(chǎn)量［5］。適量加入二氧化硫可有效殺滅果汁中的雜菌，保證發(fā)酵正常進行，因此需要酵母能夠耐受一定濃度的二氧化硫［6］。目前關(guān)于黃酒工業(yè)常用的釀造酵母、藍靛果酒酵母的耐受性及從草莓中篩選出的裂殖酵母的發(fā)酵特性已有相關(guān)報道［7－9］，而對果酒釀造過程中裂殖酵母的耐受性研究至今尚未見報道。

作者研究了實驗室自篩的裂殖酵母菌在蘋果汁中的生長特性及耐受性，以期為裂殖酵母菌應(yīng)用于果酒生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大湖100%原榨蘋果汁，購于沃爾瑪超市；葡萄糖（AR），成都化學試劑廠；無水乙醇（AR），天津市恒興化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀（AR），北京化工廠；冰乙酸（AR），大連無機化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

722S型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SHP－150生化培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；PHS－3C精密pH 計，上海精密科學儀器有限公司；WYT－5手持糖量折光儀，上海大慶光學儀器廠；RJ－TDL－5A 低速臺式大容量離心機，無錫市瑞江分析儀器有限公司。

1.3 菌 種

裂殖酵母菌：本實驗室保存，從草莓中分離而得［9］。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉10g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂20g／L，pH 6.0。

一級種子培養(yǎng)基（YPD）：酵母浸粉10g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，pH 6.0。

二級種子培養(yǎng)基：大湖100%原榨蘋果汁，加入12.8g／L酵母浸粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大湖100%原榨蘋果汁，pH 3.58，糖度13.5°Brix。

以上培養(yǎng)基均在115℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.5 培養(yǎng)方法

1.5.1 菌種的保存及活化

裂殖酵母在4℃保存于斜面培養(yǎng)基。取4℃保存的菌種，接種于斜面培養(yǎng)基，于30 ℃活化培養(yǎng)24h。

1.5.2 種子制備

一級種子：取斜面活化的菌種培養(yǎng)物2環(huán)，接入10mL一級種子培養(yǎng)基中（15 mm×150 mm試管），于30 ℃靜置培養(yǎng)24h。

二級種子：按5%的體積比將一級種子液接入100mL二級種子培養(yǎng)基中（250mL 三角瓶），于30 ℃、160r／min搖床培養(yǎng)14h。

1.6 實驗方法

1.6.1 生長曲線的測定

于10mL發(fā)酵培養(yǎng)基（15 mm×150 mm 試管）接入5%二級種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)，定時取樣測定菌體密度。

1.6.2 葡萄糖耐受性的測定

調(diào)YPD 培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度分別為100、140、180、220、260g／L。分裝10mL 不同葡萄糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基于試管（15 mm×150mm）中，滅菌冷卻后分別接入5%二級種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h的菌濃度。

1.6.3 酒精耐受性的測定

向已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的無水乙醇，調(diào)整酒精體積分數(shù)分別為0、3%、6%、9%、12%、15%、18%。10mL不同乙醇體積分數(shù)的發(fā)酵培養(yǎng)基中（15mm×150mm 試管）分別接入5%二級種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h 的菌濃度。

1.6.4 二氧化硫耐受性的測定

向已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的偏重亞硫酸鉀，調(diào)整SO2質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200mg／L。于10mL 不同SO2質(zhì)量濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中（15mm×150mm 試管）分別接入5%二級種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h的菌濃度。

1.6.5 乙酸耐受性的測定

向已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的冰醋酸，調(diào)整乙酸體積分數(shù)為0、1%、2%、3%、4%。于10mL 不同乙酸體積分數(shù)的發(fā)酵培養(yǎng)基中（15mm×150 mm 試管）分別接入5%二級種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h的菌濃度。

1.6.6 菌體密度的測定

采用比濁法于550nm 測定菌體密度［10］。取不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液10mL，4 000r／min離心8min，以上清液為對照，利用分光光度計測定發(fā)酵液的濁度。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖酵母的生長曲線

裂殖酵母的生長曲線如圖1所示。由圖1可見，裂殖酵母在培養(yǎng)0～3h的菌體密度基本保持不變，細胞處于生長延滯期；3～36h菌體密度急劇上升；36h 后細胞進入生長穩(wěn)定期，并且培養(yǎng)36～48h時菌體達到最大生長；48h后進入衰亡期。

圖1 裂殖酵母的生長曲線（30 ℃）Fig.1 Growth curve of the Schizosaccharomyces in apple juice at 30 ℃

2.2 裂殖酵母的葡萄糖耐受性

表1與圖2分別為裂殖酵母在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度YPD 中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中ρG表示YPD 中初始葡萄糖的質(zhì)量濃度。由表1和圖2可知，在不同ρG的YPD 中，裂殖酵母培養(yǎng)24h后均可發(fā)酵，隨著ρG的增加，起酵時間延長，生長受到的ρG作用也增強。與ρG為100g／L 相比，裂殖酵母在ρG高于180g／L YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～36h的產(chǎn)氣量明顯減少，培養(yǎng)48h 的菌體密度下降40%。

這是因為較高葡萄糖質(zhì)量濃度導(dǎo)致發(fā)酵液中滲透壓升高，引起細胞內(nèi)水分流失，生存能力下降。有研究表明，細胞通過HOG－MAPK 途徑，促進甘油的積累及調(diào)節(jié)其他生理活動，暫時停止生長，以抵抗應(yīng)激。高滲透壓還能誘導(dǎo)與糖代謝、戊糖磷酸途徑相關(guān)的基因表達，抑制與嘌呤、嘧啶、組氨酸和賴氨酸生物合成相關(guān)的基因表達，致使細胞的生長、代謝出現(xiàn)暫時性紊亂［11］。

表1 裂殖酵母在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度YPD 中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.1 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in YPD with different initial concentration of glucose

圖2 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.2 Effect of the initial glucose concentration on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

2.3 裂殖酵母的酒精耐受性

表2與圖3分別為裂殖酵母在不同初始酒精體積分數(shù)13.5°Brix蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中φA表示13.5°Brix蘋果汁中初始酒精體積分數(shù)。由表2和圖3可知，裂殖酵母對高體積分數(shù)酒精較為敏感，當φA高于6%時，產(chǎn)氣量、細胞生長速率和存活率減小程度較大，說明它不能耐受6%以上的酒精。酒精對酵母細胞的抑制作用很復(fù)雜，主要影響細胞生長、存活性和發(fā)酵力［12］。它能改變細胞形態(tài)，導(dǎo)致細胞骨架疏散，周期延長，從而抑制酵母菌的生長［13］。酒精還能改變細胞膜成分及完整性，影響膜攝取營養(yǎng)和向外排出酒精的能力，導(dǎo)致酵母細胞代謝不平衡［14］，進一步影響產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣量。

表2 裂殖酵母在不同初始酒精體積分數(shù)蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.2 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in apple juice with different initial concentration of alcohol

圖3 初始酒精體積分數(shù)對裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.3 Effect of the initial alcohol concentration on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

2.4 裂殖酵母的二氧化硫耐受性

表3與圖4分別為裂殖酵母在不同初始二氧化硫質(zhì)量濃度13.5°Brix蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中ρ（SO2）表示13.5°Brix蘋果汁中初始二氧化硫質(zhì)量濃度。由表3和圖4可知，與不加二氧化硫相比，裂殖酵母在ρ（SO2）超過0.15g／L的蘋果汁中培養(yǎng)24～48h的產(chǎn)氣量無顯著變化，培養(yǎng)48h的菌體密度下降30%，說明此濃度的二氧化硫僅抑制了裂殖酵母的生長而沒有抑制其代謝活性。

二氧化硫?qū)频纳锘瘜W性質(zhì)有積極的穩(wěn)定作用。它不僅可以防止酒體的氧化和變色，而且能夠抑制細菌和非釀酒酵母的活動。歐洲規(guī)定成品酒中二氧化硫的最高限量為0.2g／L。在果酒釀造過程中，二氧化硫通常以偏重亞硫酸鉀的形式加入到果汁中，而其主要通過與細胞化合物（尤其是羰基）反應(yīng)發(fā)揮它的毒性，產(chǎn)生的乙醛將作為第二重阻力進一步抑制酵母的生長與發(fā)酵［15］。

表3 裂殖酵母在不同初始二氧化硫質(zhì)量濃度蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.3 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in apple juice with different initial concentration of sulfur dioxide

圖4 初始二氧化硫質(zhì)量濃度對裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.4 Effect of the initial sulfur dioxide concentration on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

2.5 裂殖酵母的乙酸耐受性

表4與圖5分別為裂殖酵母在不同初始乙酸體積分數(shù)13.5°Brix蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中φAA表示13.5°Brix蘋果汁中初始乙酸體積分數(shù)。由表4和圖5可知，裂殖酵母對乙酸比較敏感，1%乙酸嚴重抑制了裂殖酵母的生長與發(fā)酵。乙酸影響酵母菌的生長與代謝主要原因為：乙酸通過擴散進入細胞內(nèi)，胞內(nèi)較高的pH 使乙酸離解，導(dǎo)致胞內(nèi)pH 降低，以至低于正常的生理值，進而引起蛋白質(zhì)解折疊和細胞凋亡［16］；乙酸也能直接影響酶的活性（如糖酵解的關(guān)鍵酶），進一步影響酵母菌的代謝活性［17］。

表4 裂殖酵母在不同初始乙酸體積分數(shù)蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.4 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in apple juice with different initial concentration of acetic acid

圖5 初始乙酸體積分數(shù)對裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.5 Effect of the initial concentration of acetic acid on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

3 結(jié) 論

通過產(chǎn)氣和細胞生長情況分析了裂殖酵母的耐受性。結(jié)果顯示，裂殖酵母分別在YPD 初始葡萄糖質(zhì)量濃度超過180g／L、13.5°Brix蘋果汁初始酒精體積分數(shù)超過6%或乙酸體積分數(shù)為1%條件下的生長及發(fā)酵受到強烈的抑制，而0.2g／L二氧化硫?qū)ζ湟种谱饔幂^弱。根據(jù)抵抗外界壓力的能力，裂殖酵母適用于中、低糖度（可溶性固形物15.0°Brix左右）果汁的果酒釀造。在果酒工業(yè)中，大多數(shù)國家將0.2g／L 二氧化硫作為最高允許添加量，因此實驗室所用裂殖酵母在二氧化硫耐受能力方面能夠滿足生產(chǎn)要求。關(guān)于裂殖酵母酒精發(fā)酵過程的生理學機制及發(fā)酵應(yīng)用還需進一步研究。

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