■吳逸飛 趙旭民 黃小暉 李繼光湯江武

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.義烏市華太飼料有限公司，浙江義烏 322005；3.株洲智薈生物科技有限公司，湖南株洲 412003）

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵利用糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱。一般乳酸菌不易存活，對(duì)環(huán)境的抗逆性差，不能夠耐高溫，耐酸和耐膽鹽，因此乳酸菌制品普遍存在著保存性差、易失活等缺點(diǎn)。

凝結(jié)芽孢桿菌是一類能夠形成芽孢的乳酸菌，它除了具有一般乳酸菌的維持腸道微生態(tài)平衡，提高機(jī)體消化功能和健康水平外，還具有耐高溫，耐酸、耐膽鹽等優(yōu)點(diǎn)，能有效抑制有害菌的生長，改良腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)腸道發(fā)育，增強(qiáng)腸道功能，在飼料行業(yè)有很好的應(yīng)用前景，被美國食品與藥物局（FDA）列入可用于飼料的安全微生物菌種名單。由于凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢具有易保藏、復(fù)活率高等特點(diǎn)，因而是乳酸菌商品化制劑的重要形式。目前如何通過培養(yǎng)條件調(diào)控，使凝結(jié)芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢率提高是研究重點(diǎn)。本文在前期篩選獲得一株凝結(jié)芽孢桿菌B2的基礎(chǔ)上，嘗試采用液態(tài)發(fā)酵方式，通過PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，以期進(jìn)一步提高凝結(jié)芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢數(shù)，為后期制劑的大規(guī)模生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌種：凝結(jié)芽孢桿菌B2為本實(shí)驗(yàn)室篩選，于-20℃保存。

發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，成分為葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加水至1 L，pH值7.0，115℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化：將保存的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h,備用。

1.2.2 種子液的制備：從斜面上挑取一環(huán)培養(yǎng)物接種到裝有20 ml培養(yǎng)液的50 ml三角瓶中，于30℃、220 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)：將上述種子培養(yǎng)液按1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量100 ml，于30℃、220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h。

1.2.4 培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)：首先通過PB試驗(yàn)確定影響芽孢得率的顯著培養(yǎng)基成分，再通過對(duì)顯著成分的單因素試驗(yàn)，確定其最佳添加量。

1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：在獲得最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)接種量以及發(fā)酵模式（震蕩、靜置）進(jìn)行逐一優(yōu)化。

1.2.6 計(jì)數(shù)方法

凝結(jié)芽孢桿菌的活菌總數(shù)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法；芽孢計(jì)數(shù)則采用把培養(yǎng)后菌液于80℃水浴15 min后稀釋涂平板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)原料對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)芽孢能力的影響

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌B2在若干培養(yǎng)基平板上有產(chǎn)芽孢的能力，其中以加入淀粉的平板產(chǎn)芽孢最早，在24 h產(chǎn)生，以加入蛋白胨的平板為最高，因此，綜合考慮，我們選擇幾種工業(yè)上發(fā)酵罐中常用的碳氮源作為PB實(shí)驗(yàn)的篩選因子，具體方案和結(jié)果見表1。結(jié)果分析見表2。

表1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢能力的PB實(shí)驗(yàn)

表2 PB實(shí)驗(yàn)的各因素方差分析結(jié)果

由表2可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腞2值為0.91，表明實(shí)驗(yàn)有91%的數(shù)據(jù)能夠用此模型擬合，模型情況較好。Shapiro-Wilktest表明數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。同時(shí)由表2可見，各因素的作用顯著性排序?yàn)椋旱鞍纂耍镜矸郏敬蠖狗郏酒咸烟牵窘湍父啵綤2HPO4＞(NH4)2SO4。其中顯著的因素為蛋白胨、大豆粉和淀粉。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成培養(yǎng)基的確定

根據(jù)2.1節(jié)所獲得的結(jié)果，我們選擇了蛋白胨、淀粉和大豆粉等3個(gè)因素為考察對(duì)象，其余因素取低水平。對(duì)此3因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，摸索它們的最佳添加量。

表3 蛋白胨、淀粉和大豆粉的單因素實(shí)驗(yàn)

由表3可知，淀粉最佳的添加量為0.2%、蛋白胨最佳添加量為0.5%、大豆粉最佳添加量為1.0%，結(jié)合2.1節(jié)的結(jié)果，確定凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的最佳培養(yǎng)基為淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。

2.3 接種量的單因素實(shí)驗(yàn)

在確定發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了初始種子接種量對(duì)發(fā)酵后芽孢數(shù)的影響，結(jié)果見表4。

表4 初始接種量對(duì)發(fā)酵后芽孢得率的影響

由表4可知，隨著初始種子接種量的增加，發(fā)酵后的芽孢數(shù)量也逐步提高，考慮到生產(chǎn)實(shí)際，合理的接種量應(yīng)該控制在3%～5%。

2.4 不同的培養(yǎng)方式對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢得率的影響

研究表明，提高通氣量有助于凝結(jié)芽孢桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎撸o置培養(yǎng)又可提高初始菌數(shù)。因此我們選取了3種不同的作用方式，結(jié)果見表5。由表5可知，最佳的培養(yǎng)方式為連續(xù)搖瓶的方式，在此條件下，芽孢數(shù)量可以達(dá)到3.5×108cfu/ml。

表5 不同氧氣控制方式對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的促進(jìn)作用

3 討論

隨著微生態(tài)制劑研究成為飼料添加劑研究的熱點(diǎn)，乳酸菌在動(dòng)物飼養(yǎng)中的優(yōu)勢(shì)逐步顯現(xiàn)。但絕大多數(shù)乳酸菌存在抗逆性差，不耐熱的缺點(diǎn)，給制劑的保藏、運(yùn)輸都帶來了較大困難，由于無法保證產(chǎn)品有效性，無法直接添加到配合飼料中使用。芽孢桿菌由于芽孢的生成，具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫和易儲(chǔ)存等特點(diǎn)，很好地彌補(bǔ)了乳酸菌的不足，因而產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的研究已成為益生菌菌株研發(fā)的熱點(diǎn)。許多研究報(bào)道，凝結(jié)芽孢桿菌在碳源缺乏的情況下才會(huì)形成芽孢，在碳源充足的情況下不形成芽孢，菌體會(huì)發(fā)生自溶。同時(shí)無機(jī)鹽在調(diào)控芽孢形成中發(fā)揮重要的作用，Mn2+對(duì)芽孢形成起到顯著的影響，PO43-也有利于芽孢的形成，而K+和Na+對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的形成無明顯的促進(jìn)作用。

4 結(jié)語

本試驗(yàn)通過研究表明最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基為淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。培養(yǎng)條件接種量為2%～3%（v/v），培養(yǎng)方式為震蕩培養(yǎng)。在此條件下，芽孢數(shù)量可以達(dá)到3.5×108cfu/ml，優(yōu)化后凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的能力都有了很大的提高。另一方面，本試驗(yàn)初步研究了凝結(jié)芽孢桿菌液體發(fā)酵芽孢形成的條件，還有一些因素值得探討，比如培養(yǎng)溫度，pH值以及培養(yǎng)時(shí)間等；培養(yǎng)溫度過低會(huì)導(dǎo)致菌體生長緩慢，不利于芽孢形成；過高的溫度會(huì)使菌體發(fā)生自溶，也不利于芽孢形成，因而有待進(jìn)一步研究。

（參考文獻(xiàn)15篇，刊略，需者可函索）