■張 鵬 楊自軍 宋 超 王亞壘 張菲菲 朱重偉 尚澤松

（河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003）

鉬（Molybdenum，Mo）是動物體內(nèi)必需的一種微量元素，是多種酶的組成成分，參與體內(nèi)碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、含硫氨基酸、核酸等的代謝，具有重要的生物學(xué)功能[1]。但攝入過量的鉬可導(dǎo)致動物中毒[2-3]。已經(jīng)證實，高鉬對動物的多種組織器官具有損害作用[4-5]。腎臟是動物體內(nèi)鉬含量最高的器官之一，有研究表明腎臟也是鉬毒性的靶器官[6-7]。目前，尚未見鉬暴露對小尾寒羊腎臟超微結(jié)構(gòu)和腎臟功能影響的研究報道。本試驗選擇鉬暴露小尾寒羊的腎臟為研究器官，檢測腎功能并觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化，旨在探討高鉬對小尾寒羊腎臟功能的影響和病理損傷的機(jī)理，為系統(tǒng)研究鉬對腎臟的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與日糧

2月齡健康雄性小尾寒羊18只，體重（20±1.34）kg，隨機(jī)分為3組，基礎(chǔ)日糧相同，根據(jù)體重每日分別灌服0 mg/kg（Ⅰ組）、30 mg/kg（Ⅱ組）、60 mg/kg（Ⅲ組）的鉬（鉬源為Na2MoO4·2H2O，分析純）。試驗羊常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由飲水和采食，體重7 d稱量一次。基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧配方及營養(yǎng)水平

1.2 試驗方法

1.2.1 臨床觀察

試驗羊提前集體驅(qū)蟲，自灌服鉬溶液開始，每天觀察各組試驗羊的精神狀態(tài)、食欲、皮膚被毛等情況。

1.2.2 血清肌酐和尿素氮含量的檢測

試驗第0、15、30、45、60 d，每組隨機(jī)抽取4只小尾寒羊，空腹8 h后頸靜脈采血，分離血清，用于血清肌酐（Cr）和尿素氮(BUN)含量的測定。檢測試劑盒購于南京建成生物工程公司。

1.2.3 尿蛋白含量的檢測

試驗第0、15、30、45、60 d，每組隨機(jī)抽取4只小尾寒羊，采集一晝夜的尿液，用加熱醋酸法進(jìn)行尿蛋白定性分析。

1.2.4 腎臟的超微結(jié)構(gòu)觀察

試驗第60 d，各組隨機(jī)挑選3只試驗羊宰殺，立即將腎臟組織修剪成1 mm3小塊，2.5%戊二醛溶液中固定，Epon 812包埋，超薄切片，鋨酸染色，透射電鏡（JEM-100SX）觀察腎臟的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Bonferroni多重比較法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性比較。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

在整個試驗期內(nèi)，Ⅰ組小尾寒羊未出現(xiàn)明顯病征。試驗第10 d開始，Ⅱ、Ⅲ組小尾寒羊先后出現(xiàn)精神萎頓，食欲下降，消瘦等情況；35 d以后，Ⅱ、Ⅲ組試驗羊普遍消瘦明顯，糞便稀軟如泥，喜臥少動，口色蒼白。

50 d以后，Ⅱ、Ⅲ組試驗羊出現(xiàn)不同程度的運動障礙，表現(xiàn)為行走蹣跚，站立不穩(wěn)，但無明顯關(guān)節(jié)腫脹變形；試驗后期Ⅱ、Ⅲ組試驗羊出現(xiàn)被毛脫落現(xiàn)象，嚴(yán)重者背部可見裸露皮膚，皮膚干燥蒼白。

2.2 腎臟功能檢測

2.2.1 血清肌酐和尿素氮含量的變化(見表2)

表2 血清肌酐、尿素氮濃度的變化（μmol/l）

Ⅰ組血清肌酐和尿素氮濃度前后無明顯變化（P＞0.05）。Ⅱ、Ⅲ組血清肌酐濃度隨時間的延長呈緩慢上升趨勢，在第15 d和45 d，兩組之間差異極顯著（P＜0.01）。Ⅱ、Ⅲ組血清尿素氮濃度呈持續(xù)上升趨勢，從30 d開始，Ⅱ、Ⅲ組血清尿素氮濃度與Ⅰ組差異極顯著（P＜0.01），Ⅱ、Ⅲ組之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.2 尿蛋白量的檢測（見表3）

表3 各組試驗羊不同階段尿蛋白量（g/l）

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組在試驗開始前的尿蛋白量差異不顯著，都在0.1 g/l左右。隨著飼喂時間的延長，Ⅱ、Ⅲ組試驗羊的尿蛋白量均呈上升趨勢（P＜0.01或P＜0.05）。試驗第45 d，Ⅲ組試驗羊的尿蛋白量達(dá)0.60 g/l，且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間尿蛋白量差異極顯著（P＜0.01）。

2.3 超微結(jié)構(gòu)變化

圖1 Ⅰ組腎小管上皮細(xì)胞（TEM×20 000）

圖2 Ⅱ組血管球系膜細(xì)胞，溶酶體增多（TEM×10 000）

圖3 Ⅱ組腎小管上皮細(xì)胞，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒（TEM×20 000）

Ⅰ組腎小球和腎小管均無明顯的超微結(jié)構(gòu)變化，胞核及各種細(xì)胞器的形態(tài)均無異常(見圖1)；Ⅱ組腎小球毛細(xì)血管腔略有腫脹，血管球系膜細(xì)胞內(nèi)溶酶體增多(見圖2)，腎小管上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，脫顆粒。線粒體有輕度變形、腫脹(見圖3)，部分細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯(見圖4)；Ⅲ組腎小管上皮細(xì)胞空泡化現(xiàn)象普遍(見圖5)，同時細(xì)胞內(nèi)溶酶體明顯增多，血管球基膜出現(xiàn)沉積性基膜增厚，電鏡下可見基膜和內(nèi)皮細(xì)胞之間有電子致密物沉積(見圖6)。部分細(xì)胞核胞質(zhì)濃縮，嗜酸性反應(yīng)增強(qiáng)，染色質(zhì)濃縮邊集于核膜下，胞核周圍可見較多初級溶酶體(見圖7)。腎小球上皮細(xì)胞內(nèi)可見多數(shù)線粒體因腫脹而變大變圓，電子密度增加，嚴(yán)重者形成空泡(見圖8、圖9)。部分上皮細(xì)胞胞漿溶解，細(xì)胞器消失，僅剩空泡化的線粒體，足突發(fā)生融合，裂管消失，原來附于基底的排列有序的足突代之以帶狀結(jié)構(gòu)，貼敷于基底膜上。毛細(xì)血管基底膜微細(xì)結(jié)構(gòu)消失(見圖10)。

圖4 Ⅱ組腎小管上皮細(xì)胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯（TEM×20 000）

圖5 Ⅲ組腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞空泡化（TEM×5 000）

圖6 Ⅲ組腎小管上皮細(xì)胞，溶酶體增多，血管球基膜增厚（TEM×5 000）

圖7 Ⅲ組腎小管上皮細(xì)胞，染色質(zhì)濃縮邊集于核膜下（TEM×8 000）

圖8 Ⅲ組腎小球上皮細(xì)胞，線粒體腫脹（TEM×20 000）

圖9 Ⅲ組腎小球上皮細(xì)胞，線粒體空泡化（TEM×20 000）

3 討論與結(jié)論

3.1 高鉬對小尾寒羊腎臟超微結(jié)構(gòu)的影響

本試驗中后期高鉬組小尾寒羊出現(xiàn)腹瀉、被毛脫落、行走蹣跚等典型鉬中毒癥狀，且Ⅲ組試驗羊臨床狀態(tài)最差。超微結(jié)構(gòu)觀察表明，鉬中毒所致腎臟損傷主要集中在細(xì)胞中的膜系結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒，線粒體腫脹變性甚至空泡化，溶酶體增多等。這與前人對雛雞鉬中毒的研究結(jié)果相似[7]。本試驗中，受損傷的腎小管上皮細(xì)胞線粒體基質(zhì)腫脹，嵴減少甚至消失，內(nèi)層膜結(jié)構(gòu)破損后在基質(zhì)中重新閉合形成空泡；溶酶體明顯增多、增大，內(nèi)含顆粒樣高電子密度物質(zhì)；部分上皮細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮邊集，有凋亡趨勢。而腎小球的損傷主要體現(xiàn)在血管球基膜和足細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的變化，如血管基膜增厚，足細(xì)胞裂管消失等。因此推測，鉬中毒所致腎臟的損害主要是腎小管上皮細(xì)胞受損，嚴(yán)重時累及腎小球。

圖10 腎小球上皮細(xì)胞，胞漿溶解，足突發(fā)生融合，裂管消失（TEM×5 000）

3.2 高鉬對小尾寒羊腎臟功能的影響

肌酐主要來自于肌肉的代謝，經(jīng)腎臟濾過并隨尿液排出體外，其在血中的濃度可反映腎臟濾過能力[8]。本試驗中血清肌酐含量隨著鉬暴露時間的延長而呈上升趨勢，說明高劑量的鉬使腎小球濾過率下降，造成血液中肌酐含量上升，提示腎功能下降。尿素氮是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的主要終產(chǎn)物，90%以上通過腎臟排泄，尿素從腎小球濾過后在各段小管均可重吸收[9]。本試驗結(jié)果顯示，在鉬添加量超過30 mg/kg時，從第30 d開始Ⅱ、Ⅲ組尿素氮含量極顯著高于Ⅰ組，說明高鉬在影響腎小球濾過功能的同時干擾腎小管對尿素氮的重吸收，導(dǎo)致動物機(jī)體尿素代謝紊亂。正常尿液中蛋白含量不會超過0.5 g/l，尿液中蛋白增多是腎臟受損的一個重要標(biāo)志，其含量與持續(xù)程度是判斷腎臟損傷程度的依據(jù)[10-11]。本試驗結(jié)果顯示，隨著鉬暴露時間的延長，試驗羊的尿蛋白量呈快速上升趨勢，在試驗第45 d時，Ⅲ組試驗羊的尿蛋白量達(dá)0.6 g/l，且Ⅱ、Ⅲ組之間差異極顯著（P＜0.01），提示腎功能受損傷程度與鉬暴露水平之間存在劑量-時間效應(yīng)關(guān)系。