■饒 瑞 桂慶平 鄭宗林 Claire Yew Yoke Ching 劉鴻艷

(1.銅仁市漁政管理所，貴州銅仁 554300；2.西南大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物繁育和健康養(yǎng)殖研究中心，重慶 402460；3.BEDSON S.A.,阿根廷；4.山東省濱州市海洋漁業(yè)局濱州海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)站，山東濱州 256600)

黃曲霉毒素B1(AFB)主要由黃曲霉菌產(chǎn)生，它將嚴(yán)重影響玉米、花生和其他作物的使用價(jià)值[1]。對(duì)AFB的研究發(fā)現(xiàn)，其除了具有很強(qiáng)的致癌作用外[2-3]，還能夠抑制水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)，并摧毀其免疫系統(tǒng)[4-5]。肝臟是對(duì)AFB敏感的器官，但不同種類的魚(yú)對(duì)AFB的易感性千差萬(wàn)別，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）對(duì)AFB非常敏感[6]，然而其他的魚(yú)類，如斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus Punctaus），只有在高劑量時(shí)才受影響[6-8]。用含0.1 mg/kg AFB的日糧飼喂尼羅羅非魚(yú)（Tilapia nilotica）10周，羅非魚(yú)出現(xiàn)生長(zhǎng)受阻，而且飼喂含0.2 mg/kg AFB的日糧已經(jīng)有了16.7%的死亡率[9]。Nguyen研究發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚(yú)飼喂100 mg/kg的AFB日糧8周后出現(xiàn)死亡率上升和肝損傷現(xiàn)象[10]。

菜薊提取物已被研究證明對(duì)肝臟功能有正面影響[11]，并能誘導(dǎo)膽汁分泌到腸道中，促進(jìn)腸道對(duì)脂肪酸和脂溶性氨基酸的吸收[12-13]。菜薊提取物還具有清除自由基等功效[14]。菜薊提取復(fù)合物由菜薊提取物與氯化膽堿等成分復(fù)方組合而成。但目前沒(méi)有任何關(guān)于菜薊提取復(fù)合物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑或者保肝劑的報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過(guò)多項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)菜薊提取復(fù)合物對(duì)AFB攻毒的羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)的生長(zhǎng)以及肝臟保護(hù)機(jī)能的效果。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧

試驗(yàn)分為3組，具體情況見(jiàn)表1，AFB純品購(gòu)于Westingarea(USA)。基礎(chǔ)日糧或摻入了AFB和菜薊提取復(fù)合物的日糧均在Hobart攪拌機(jī)中混合，然后在直徑為2.4 mm的Hobart絞肉機(jī)上制粒，室溫下風(fēng)干，破碎成小塊后4℃保存?zhèn)溆?。基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。飼喂試驗(yàn)持續(xù)8周。每次投喂后1 h收集未被攝食飼料，置105℃風(fēng)干并稱重。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 試驗(yàn)魚(yú)及養(yǎng)殖條件

試驗(yàn)前，羅非魚(yú)投喂基礎(chǔ)日糧暫養(yǎng)2周。然后將270尾體重接近的羅非魚(yú)[(60.0±2.5)g]分成9組，分別置于蓄水體積200 L的玻璃缸中，循環(huán)流水并保持在1.5 L/min左右，溶氧控制在 4～6 mg/l，試驗(yàn)期間平均水溫（25±1）℃。

1.3 樣品采集和分析方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能檢測(cè)

8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，每組單獨(dú)稱重并采集試驗(yàn)需要的組織。每只缸隨機(jī)抽取5尾魚(yú)解剖，采集肝臟和其它內(nèi)臟組織，用以計(jì)算肝體指數(shù)(HSI)和內(nèi)臟指數(shù)(VSI)等，背部肌肉和肝臟樣品密封在塑料袋中并冰凍保存（-18℃）備用。

增重率(PWG，%)=100×(末重-初重)/初重；

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=100×ln(末重/初重)/試驗(yàn)天數(shù)；

飼料系數(shù)(FCR)=飼料消耗/體增重；

肝體指數(shù)(HSI)=100×肝臟重/總體重；

內(nèi)臟指數(shù)(VSI)=100×內(nèi)臟重/總體重；

肥滿度(CF，g/cm3)=100×體重/(體長(zhǎng))3。

飼料、魚(yú)肌肉樣的粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分，以及肝臟脂肪含量參照AOAC（1995）的方法確定。

1.3.2 肝臟抗氧化活性測(cè)定

4℃條件下，肝臟樣品經(jīng)離心（600×g）后，取上清液用于各指標(biāo)測(cè)定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性參照Misra等的方法測(cè)定，略有改動(dòng)[15]；過(guò)氧化氫酶(CAT)活性參照Aebi的方法測(cè)定[16]；丙二醛含量參照Mertens等的方法來(lái)測(cè)量。

1.3.3 血漿生化指標(biāo)和病理學(xué)的測(cè)量

在8周飼喂試驗(yàn)后，從每缸中挑選5尾羅非魚(yú)用MS-222麻醉，然后用1 ml無(wú)菌注射器尾靜脈抽取1.5 ml血液，用肝素抗凝。血液在4℃條件下離心（700×g）30 min，再用HITACHI 7200型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血液生化指標(biāo)；血液中酸性糖蛋白(AGP)采用美國(guó)Cardiotech公司的糖蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定；血細(xì)胞比容(Hct)用Agrawal等所描述的方法測(cè)定[17]。

每個(gè)魚(yú)缸隨機(jī)取3尾魚(yú)，獲取其肝臟做常規(guī)切片。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有的結(jié)果都以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS11.5對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果有顯著差異時(shí)，進(jìn)行Duncan's法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)生長(zhǎng)性能的影響

8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能與不同處理間的日糧差異顯著相關(guān)，見(jiàn)表3。飼料中含AFB后，羅非魚(yú)的增重率、特定生長(zhǎng)率、成活率比對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），成活率顯著降低至50%，而餌料系數(shù)則顯著提高1倍多（P＜0.05）；但在含AFB的飼料中補(bǔ)充了菜薊提取復(fù)合物后，其增重率、特定生長(zhǎng)率、成活率和餌料系數(shù)都得到明顯改善，與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

表3 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響(n=3；±SD)

表3 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響(n=3；±SD)

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示顯著差異(P＜0.05)；下表同。

項(xiàng)目增重率(%)特定生長(zhǎng)率(%/d)餌料系數(shù)成活率(%)菜薊補(bǔ)充組171.49±4.27a 1.73±0.13a 1.52±0.13a 89.48±5.24a對(duì)照組166.93±6.51a 1.70±0.11a 1.46±0.11a 91.36±5.41a黃曲霉毒素B1組53.74±5.47b 0.49±0.02b 3.57±0.02b 49.84±7.47b

2.2 對(duì)羅非魚(yú)形體指標(biāo)的影響

飼料中添加100 mg/kg AFB后，羅非魚(yú)肥滿度顯著降低（P＜0.05），而肝體指數(shù)和內(nèi)臟指數(shù)則顯著升高（P＜0.05）。但在含AFB的飼料中補(bǔ)充了菜薊提取復(fù)合物后，其肥滿度、肝體指數(shù)和內(nèi)臟指數(shù)得到明顯改善，與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），甚至肝體指數(shù)較對(duì)照組還有一定程度地降低（見(jiàn)表4）。

表4 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)形體指標(biāo)的影響(n=3；±SD)

表4 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)形體指標(biāo)的影響(n=3；±SD)

項(xiàng)目肥滿度(g/cm3)肝體指數(shù)內(nèi)臟指數(shù)對(duì)照組2.46±0.16a 1.90±0.14a 9.06±0.23a黃曲霉毒素B1組1.71±0.15b 2.61±0.14b 10.80±0.34b菜薊補(bǔ)充組2.36±0.11a 1.78±0.13a 9.24±0.21a

2.3 對(duì)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分的影響

AFB的添加或在AFB的飼料中補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)肌肉粗脂肪和粗灰分含量無(wú)顯著影響（P＞0.05），但AFB的添加導(dǎo)致羅非魚(yú)肌肉水分和肝臟粗脂肪含量顯著增加，肌肉粗蛋白含量的顯著下降（P＜0.05），而在含AFB的飼料中補(bǔ)充了菜薊提取復(fù)合物后，其肌肉水分、粗蛋白和肝臟粗脂肪含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），基本恢復(fù)正常（見(jiàn)表5）。

表5 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分的影響(n=3；±SD)(%)

表5 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分的影響(n=3；±SD)(%)

項(xiàng)目肌肉水分肌肉粗蛋白肌肉粗脂肪肌肉粗灰分肝臟粗脂肪對(duì)照組76.42±0.66a 18.70±0.13a 4.07±0.27a 1.22±0.13a 42.57±1.12a黃曲霉毒素B1組78.57±0.62b 16.97±0.21b 4.00±0.20a 1.18±0.03a 45.36±0.73b菜薊補(bǔ)充組76.79±0.27a 18.32±0.25a 3.85±0.09a 1.18±0.07a 41.10±1.38a

2.4 對(duì)肝臟抗氧化機(jī)能的影響

試驗(yàn)以羅非魚(yú)肝臟超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)生成量來(lái)判定其抗氧化性能(見(jiàn)表6)。從表6中可知，AFB的添加使羅非魚(yú)的SOD和CAT活性及MDA生成量較對(duì)照組顯著提高(P＜0.05)；補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物后，MDA生成量較AFB組又顯著降低（P＜0.05），但仍然顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而SOD和CAT活性則恢復(fù)至與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表6 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)肝臟抗氧化機(jī)能的影響（n=3；±SD）

表6 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)肝臟抗氧化機(jī)能的影響（n=3；±SD）

項(xiàng)目超氧化物歧化酶(U/mg)過(guò)氧化氫酶(U/mg)丙二醛(nmol/mg)對(duì)照組168.90±17.92a 0.22±0.03a 85.31±9.16a黃曲霉毒素B1組233.05±27.14b 0.41±0.07b 335.03±71.38b菜薊補(bǔ)充組182.17±10.41a 0.19±0.03a 147.16±13.17c

2.5 對(duì)羅非魚(yú)血漿生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表7）

羅非魚(yú)的紅細(xì)胞比容(Hct)因AFB的添加而顯著降低(P＜0.05)，而丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和α-酸性糖蛋白(AGP)含量則顯著提高(P＜0.05)；菜薊提取復(fù)合物補(bǔ)充后，上述指標(biāo)又恢復(fù)至與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。唯一例外的是膽汁酸(BA)生成量，AFB的添加導(dǎo)致BA生成量顯著減少(P＜0.05)，而補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物后，BA生成量顯著增加，并顯著超過(guò)了對(duì)照組(P＜0.05)，可見(jiàn)菜薊提取復(fù)合物對(duì)BA的生成有顯著的影響。

表7 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)血液生化指標(biāo)的影響(n=3；±SD)

表7 菜薊提取復(fù)合物對(duì)羅非魚(yú)血液生化指標(biāo)的影響(n=3；±SD)

項(xiàng)目紅細(xì)胞比容(%)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/l)天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/l)α-酸性糖蛋白(mg/l)膽汁酸(mmol/l)對(duì)照組39.47±5.41a 42.46±8.31a 189.15±17.00a 84.84±8.14a 64.92±4.40a黃曲霉毒素B1組14.05±3.41b 79.70±13.38b 377.66±15.01b 185.97±26.88b 45.30±2.26b菜薊補(bǔ)充組31.38±7.41a 56.41±9.46a 224.63±28.18a 106.96±13.53a 80.43±3.13c

2.6 對(duì)肝細(xì)胞的影響

在正常的羅非魚(yú)肝臟(見(jiàn)圖1)中，肝細(xì)胞和細(xì)胞核大小及形狀規(guī)則而均勻，肝臟中脂褐素較稀少。

圖1 空白組羅非魚(yú)肝臟（H&E,×200）

飼喂含AFB日糧的羅非魚(yú)細(xì)胞質(zhì)空泡化，出現(xiàn)明顯的核偏位和嚴(yán)重的脂肪浸潤(rùn)（見(jiàn)圖2）。

圖2 飼喂含100 mg/kg AFB日糧的羅非魚(yú)肝臟（H&E,×200）

然而，在含AFB的日糧中補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物后，羅非魚(yú)肝臟組織中形成大量的嗜堿性細(xì)胞包圍著壞死的細(xì)胞，但并未形成明顯結(jié)節(jié)。細(xì)胞空泡化、核偏位、脂質(zhì)浸潤(rùn)等情況明顯緩解(見(jiàn)圖3)。

圖3 飼喂含100 mg/kg AFB以及300 mg/kg菜薊提取復(fù)合物日糧的羅非魚(yú)肝臟（H&E,×200）

3 討論

Cha'vez-Sa'nchez等(1994)用含30 mg/kg AFB的日糧飼喂羅非魚(yú)25 d，發(fā)現(xiàn)死亡率和飼料中AFB的水平之間有直接聯(lián)系[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂含100 mg/kg的AFB日糧的羅非魚(yú)8周，其死亡率明顯增加，而與對(duì)照組相比，飼喂含AFB和菜薊提取復(fù)合物為補(bǔ)充的日糧之后成活率差異不顯著。由此可以推測(cè)飼料中一定含量的AFB對(duì)羅非魚(yú)是有致死作用的，而菜薊提取復(fù)合物能增強(qiáng)魚(yú)體機(jī)能，以改善AFB等的負(fù)面影響，降低死亡率。

本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充100 mg/kg AFB的日糧飼喂羅非魚(yú)后，對(duì)其體增重和餌料系數(shù)等都有顯著的副作用。Nguyen A.T(2002)報(bào)道，2.5 mg/kg AFB可顯著降低羅非魚(yú)的體增重[10]。Cha'vez-Sa'nchez等(1994)對(duì)奧尼羅非魚(yú)的研究也發(fā)現(xiàn)相似情況，飼喂含1.88 mg/kg及以上含量的AFB導(dǎo)致增重下降，但直至30 mg/kg濃度的AFB仍然未對(duì)羅非魚(yú)FCR有顯著影響[18]。含2.15 mg/kg的AFB日糧飼喂斑點(diǎn)叉尾鮰10周導(dǎo)致其增重率下降24%[7]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在含AFB的日糧中補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物之后，羅非魚(yú)的增重率及成活率與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。事實(shí)上，本研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)飼喂含AFB的日糧后常有回吐飼料的情況發(fā)生，但是補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物后回吐飼料的情況大為減少?？赡艿脑蚴遣怂E提取復(fù)合物的補(bǔ)充可一定程度降低日糧中AFB對(duì)羅非魚(yú)的毒性。

肝臟是魚(yú)體內(nèi)最易受AFB侵襲的器官[2]。本試驗(yàn)還對(duì)肝臟進(jìn)行了病理觀察，結(jié)果顯示AFB致使羅非魚(yú)細(xì)胞質(zhì)空泡化，出現(xiàn)明顯的核偏位和嚴(yán)重的脂肪浸潤(rùn)，而在AFB日糧中補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物后，羅非魚(yú)肝臟組織中形成大量嗜堿性細(xì)胞包圍著壞死的細(xì)胞，但并未形成明顯結(jié)節(jié)，由此推測(cè)這些嗜堿性細(xì)胞其實(shí)是新生的肝細(xì)胞，說(shuō)明菜薊提取復(fù)合物能刺激肝細(xì)胞的發(fā)生。

日糧中添加AFB和菜薊提取復(fù)合物，都能對(duì)羅非魚(yú)肝臟抗氧化酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生顯著的影響。AFB的添加使肝臟過(guò)氧化物酶的活性顯著提高，而菜薊提取復(fù)合物的補(bǔ)充對(duì)肝臟有明顯的保護(hù)作用。

血漿中ALT和AST的活性增加預(yù)示著肝(實(shí)質(zhì))細(xì)胞受到了破壞，酶液流出并進(jìn)入了血液中[19]。血漿中ALT和AST活性已經(jīng)被用于檢測(cè)一些魚(yú)類的肝臟受損情況[8,19-20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AFB的添加導(dǎo)致了羅非魚(yú)血漿中ALT和AST的活性顯著升高，而在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物之后，血漿中ALT和AST的活性明顯降低。

菜薊提取物已經(jīng)被證明能促使膽汁的產(chǎn)生及分泌入腸道中，從而影響脂肪酸和脂溶性氨基酸的吸收[12-13]。此外，它還能夠清除自由基并且抑制某些粒細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶的活性[14]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AFB造成了羅非魚(yú)的肝損傷，并導(dǎo)致膽汁分泌量減少，而菜薊提取復(fù)合物的補(bǔ)充抵消了其部分負(fù)面作用，增強(qiáng)了肝臟膽汁的分泌，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。Hct是一種測(cè)定紅血細(xì)胞在全血中百分比的檢測(cè)方法，這種檢測(cè)方法與血細(xì)胞的數(shù)量和大小有關(guān)，AFB和菜薊提取復(fù)合物對(duì)Hct的影響與對(duì)膽汁酸的分泌效果一致。

AGP是一種在動(dòng)物肝臟中合成并在動(dòng)物血液中發(fā)現(xiàn)的急相期蛋白，如AGP的水平在動(dòng)物遭受疾病和應(yīng)激的情況下升高，甚至動(dòng)物未出現(xiàn)臨床癥狀；如AGP在炎癥和疾病的急性或慢性期變高。含AFB的日糧飼喂羅非魚(yú)后誘發(fā)其血漿中AGP水平顯著提高，AGP在肝臟中大量合成并進(jìn)入血液，但是補(bǔ)充菜薊提取復(fù)合物后，羅非魚(yú)血漿中AGP水平恢復(fù)正常。切片結(jié)果也表明，菜薊提取復(fù)合物有利于羅非魚(yú)因AFB受損的肝臟新生。

綜上可知，含一定劑量的黃曲霉毒素B1（AFB）的日糧對(duì)羅非魚(yú)的生長(zhǎng)會(huì)造成顯著的負(fù)面影響，同時(shí)導(dǎo)致明顯的肝損傷，而菜薊提取復(fù)合物的補(bǔ)充能夠減少羅非魚(yú)的死亡，有效地保護(hù)其肝臟，并促進(jìn)羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。