管泳宇， 于 海， 葛慶豐， 吳滿剛， 汪志君

（揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

豆豉是我國傳統(tǒng)的調味品，不僅具有良好的風味，而且含有降血壓、抗氧化成分[1]。發(fā)酵豆豉主要利用微生物發(fā)酵作用，使其產生特殊風味、色澤和質地[2]。豆豉發(fā)酵過程會發(fā)生一系列的反應，根據菌種、工藝的不同，影響豆豉的理化性質并產生大量不同的揮發(fā)性風味物質[3]。豆豉可分為:細菌型、曲霉型、毛霉型、根霉型豆豉。曲霉型豆豉的發(fā)酵分為前發(fā)酵與后發(fā)酵兩部分，之間存在洗霉、添加香料的過程。傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉加工周期較長、加工過程難以控制，添加人工發(fā)酵劑能夠縮短生產周期，控制產品質量、提高產品質量穩(wěn)定性[4]。作者旨在研究微生物作用對豆豉后發(fā)酵期間理化性質及風味的影響，為人工發(fā)酵劑的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆:超市購買。 NaOH、NaCO3、甲醛、三氯乙酸、苯酚、麝香草酚酞、3，5-二硝基水楊酸、羧甲基纖維素鈉、酒石酸鉀鈉、石油醚等:均為分析純，蛋白胨、牛肉膏、酵母膏:生化純。

1.2 儀器與設備

WFJ2000分光光度計:尤尼柯（上海）儀器有限公司；755S紫外-可見分光光度計:上海棱光技術有限公司；蛋白質測定儀KDN-04A:上海貝特儀電設備廠；高速冷凍離心機5804R:北京艾澤信科技有限公司；索氏抽提器SXT-06型:上海洪紀儀器設備有限公司；Trace GC/MS:Finnigan。

1.3 方法

1.3.1 微生物菌相分析 取曲樣2.0 g，加入20 mL滅菌生理鹽水 （內含體積分數0.1%吐溫80，置于140 r/min搖床30 min，取上述液體200 μL注入無菌試管，經稀釋后分別作細菌、耐鹽酵母、霉菌計數[5]。取樣液1 mL置于沸水浴中，煮沸10 min，冷卻，經稀釋后作芽孢菌計數。挑取單菌落培養(yǎng)物進一步作分離純化，經革蘭氏染色、鏡檢和生化試驗，作出鑒定。以溶血性實驗和小鼠腹腔注射試驗剔除病原菌。

1.3.2 微生物酶活力測定 取5.0 g樣品，用研缽研碎，勻漿，加水定容至100 mL，抽濾，濾液用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液適當稀釋。蛋白酶活力測定采用Folin法[6]，纖維素酶活力測定使用Matsuura和Obata的方法[7]。

1.3.3 理化指標測定 豆豉曲樣總酸測定使用堿滴定法，參照GB12456-2008進行；氨基酸氮測定使用甲醛滴定法，參照GB/T12143.2-89進行；還原糖測定使用DNS法，參照GB/T15038-2006進行；總脂肪測定使用索氏抽提法，參照GB/T14772-1993進行。

1.3.4 豆豉揮發(fā)性風味物測定

1）樣品處理:取樣于-20℃保藏備用，準確稱取4.0 g放入15 mL萃取瓶，密封備用。測定使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法。

2）微萃取條件:載氣體積流量0.8 mL/min，分流比為 50∶1。萃取頭為復合式 75 μm Car/PDMS 型；萃取條件為60℃保持90 min；解吸條件為250℃解吸2 min[7]。

3）氣相色譜條件:毛細管色譜柱為DB-5MS型，長 60 m，內徑 0.32 mm，涂層厚 1 μm。 載氣為He，不分流，恒流12 mL/min；進樣口溫度為250℃，解析2 min。程序升溫為起始溫度40℃保持1 min，以50℃/min升至130℃，80℃/min升至200℃，12℃/min升至250℃，保持10 min，GC與MS接口溫度為250℃。

4）質譜條件:離子源為EI源，溫度為200℃，接口溫度為250℃，檢測器電壓350 V，發(fā)射電流150 μA，掃描范圍33～500 AMU。化合物經計算機檢索，與 NIST library（170 k compounds）相匹配，相似指數（SI）800以上為確認化合物（最大值為1000）。相對百分含量按峰面積歸一化計算。用SAS9.1.3軟件對試驗數據進行分析[8]。

2 結果與分析

2.1 微生物總數與酶活性的測定

2.1.1 微生物分離與菌相分析 從發(fā)酵豆豉后發(fā)酵過程中分離得到乳酸菌39株、葡萄球菌7株、芽孢菌2株、酵母2株。葡萄球菌經革蘭氏染色和顯微鏡觀察篩選出革蘭氏陽性的純菌株5株，不產生溶血圈、血漿凝固酶陰性的菌株3株。注射菌液的實驗小鼠無不良反應，表明所篩選葡萄球菌為非致病性菌株，芽孢菌鑒定為枯草芽孢桿菌。發(fā)酵過程菌相變化見圖1。

圖1 后發(fā)酵過程菌相變化Fig.1 Changes of microbial flora during the later process of fermentation

由圖1看出，微生物菌落總數從制曲末期的2.1×109cfu/mL迅速下降至2.5×105cfu/mL?？赡苡捎诎l(fā)酵罐中添加大量食鹽，滲透壓快速升高，大部分非耐鹽細菌生長受到抑制，大量死亡。4～7 d期間，非耐鹽細菌因惡劣環(huán)境加劇繼續(xù)死亡，而此時耐鹽菌適應了高鹽環(huán)境而存活，細菌死亡速度明顯下降。10 d開始，細菌菌落總數無明顯變化?？赡艿脑蚴悄望}菌[9]適應高鹽環(huán)境，繼續(xù)緩慢生長；非耐鹽菌基本死亡?？莶菅挎邨U菌轉入后發(fā)酵后4 d大量繁殖，而后迅速下降?？赡苡捎诖司鸀槟望}需氧菌，后發(fā)酵初期豆豉曲中氧氣充足，該菌生長旺盛，隨后豆豉曲中氧氣消耗殆盡，該菌死亡。酵母在整個過程中數量有所上升，可能因為其具有耐鹽性且隨著發(fā)酵的進行，豆豉曲有利于酵母生長[10]。

2.1.2 后發(fā)酵過程蛋白酶活力變化 后發(fā)酵過程蛋白酶活力變化見圖2。

圖2 后發(fā)酵過程蛋白酶活性變化Fig.2 Changes of proteinase activity during the later process of fermentation

如圖2可知，蛋白酶活性自初始的190.24 U/g下降到1.58 U/g，主要因為制曲過程黃曲霉產生大量的蛋白酶同樣作用于后發(fā)酵，這些蛋白酶分解豆豉中的蛋白質，形成氨基酸、糖類等豆豉固有的風味物質。隨著后發(fā)酵的進行，蛋白酶在高滲下大量失活，乳酸菌、酵母無法產生大量蛋白酶，蛋白酶活力加速降低。

2.1.3 后發(fā)酵過程纖維素酶活力變化 后發(fā)酵過程纖維素酶活力變化見圖3。由圖3可知，1～4 d時，纖維素酶酶活由初始0.16 U/g上升到0.23 U/g，4～20 d，酶活下降到0.15 U/g。制曲過程的主要菌種為黃曲霉，而黃曲霉產生的纖維素酶量很小，初始酶活很小。隨著發(fā)酵的進行，芽孢桿菌迅速生長，纖維素酶明顯增加，4 d時達到最大。之后伴隨著芽孢桿菌的死亡、纖維素酶失活，酶活力總體呈下降趨勢。

2.2 還原糖與脂肪及揮發(fā)性風味物質量分數的變化

2.2.1 后發(fā)酵過程還原糖變化 后發(fā)酵過程還原糖變化見圖4。由圖4可知，在1～7 d時，還原糖初始質量分數為74.65 mg/g，隨著發(fā)酵的進行，上升到86.79 mg/g；7～20 d時還原糖質量分數下降至 60 mg/g。這主要可能由于后發(fā)酵開始階段，微生物的生長需要分解部分碳水化合物生成還原糖，導致還原糖質量分數上升。7 d后，由于乳酸菌的生長和酵母的厭氧發(fā)酵都需要消耗還原糖[11]，還原糖質量分數逐漸下降。

圖3 后發(fā)酵過程纖維素酶活性變化Fig.3 Changes of cellulase activity during the later process of fermentation

圖4 后發(fā)酵過程還原糖變化Fig.4 Changes of reducing sugar during the later process of fermentation

2.2.2 后發(fā)酵過程脂肪變化 后發(fā)酵過程脂肪變化見圖5。

圖5 后發(fā)酵過程脂肪變化Fig.5 Changesoffatduring thelaterprocessof fermentation

微生物分解脂肪產生大量小分子物質，同時微生物利用脂肪合成有機體，脂肪被氧化產生酮類等風味物質[12]。由圖5可知，總脂肪質量分數呈下降趨勢，初始為21.92%，而后下降至17.54%。前7天，脂肪含量下降趨勢較慢，可能由于發(fā)酵過程中微生物大量死亡，利用小分子碳水化合物與脂肪合成有機體且脂肪分解能力降低，只進行脂肪的自動氧化[13]。7～17 d，脂肪含量下降趨勢加快，此過程乳酸菌與酵母適應了高滲環(huán)境開始生長，利用脂肪合成有機體、分解脂肪。17 d以后，脂肪含量未發(fā)生明顯變化，乳酸菌在高酸環(huán)境與酵母抑制下生長趨于停滯，酵母菌生長緩慢，脂肪分解程度減少。

2.2.3 后發(fā)酵過程風味物質變化 后發(fā)酵過程風味物質變化見表1。

表1 不同發(fā)酵過程揮發(fā)性成分質量分數比較Table 1 Identified volatile compounds and their relative contents in different fermentation process

續(xù)表1

由表1可知，后發(fā)酵揮發(fā)性成分主要有酸類（50.58%）、脂類（25.09%）、芳香族類（4.61%）、烯烴類（1.23%）、醇類（5.93%）、吡嗪類（3.42%）。 前發(fā)酵揮發(fā)性成分主要有酸類（50.15%）、醛類（10.66%）、脂類（6.55%）、烷烴類（6.01%）、烯烴類（5.86%）、醇類（4.55%）、酮類（3.12%）、芳香族類（2.73%）。

后發(fā)酵期間脂類物質、酸類物質、醇類物質、吡嗪類物質、芳香族類物質明顯增多，烴類物質、酮類物質明顯降低。這可能由于黃曲霉能夠分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶系，大豆中蛋白質、脂肪含量較高，分解產生氨基酸、脂肪酸、酮類等風味物質[13]。后發(fā)酵期間乳酸菌進一步分解大分子物質，產生小分子風味物質，猶以酸類居多。酵母菌無氧發(fā)酵分解大分子物質的同時產生乙醇，乙醇能夠與酸類物質產生酯類物。Berdague等[14]研究表明，一些酯類物質如丙酸乙酯、醋酸丙酯、丁酸乙酯來自碳水化合物的代謝發(fā)酵過程。吡嗪類物質是美拉德反應的中間產物之一，對風味有重要作用。

2.3 后發(fā)酵過程總酸與氨基酸氮的變化

2.3.1 后發(fā)酵過程總酸的變化 后發(fā)酵過程總酸變化見圖6。由圖6可知，總酸的質量分數從0.54%逐漸增加到1.57%。1～8 d期間，因乳酸菌的大量生長產生大量的淀粉酶和脂肪酶，使碳水化合物和脂肪分解成有機酸和脂肪酸[15]，酸度明顯增大。8～15 d，隨著酸度的增大，乳酸菌自身生長受到抑制，同時高酸度與一定的糖分使得酵母菌增殖，也抑制了乳酸菌的生長。此時乳酸菌繁殖與凋亡達到平衡，表現為乳酸菌質量分數穩(wěn)定于1.57%。

圖6 后發(fā)酵過程總酸變化Fig.6 Changes of acid during the later process of fermentation

2.3.2 后發(fā)酵過程氨基酸氮的變化 后發(fā)酵過程氨基酸氮的變化見圖7。氨基酸氮是風味物質的重要組成，氨基酸氮含量能夠反映蛋白質的水解程度，豆豉后發(fā)酵進程可以通過氨基酸氮的變化確定[16]。由圖7可知，1～11 d，氨基酸氮質量分數變化較快，后期趨平衡于0.73%，表明豆豉發(fā)酵成熟。此外結合圖1可知，氨基酸氮變化的趨勢與菌相變化的趨勢基本吻合，后發(fā)酵前期微生物數目較多、酶活較高；后期由于微生物數目迅速降低、產酶下降且食鹽致酶失活，酶活降低，氨基酸氮質量分數沒有明顯增加。

圖7 后發(fā)酵過程氨基酸氮變化Fig.7 Changes of amino acid nitrogen during the later process of fermentation

3 結語

豆豉后發(fā)酵是多菌聯合發(fā)酵的過程[17]。作者初步分析了乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌對豆豉理化性質和風味的影響。芽孢桿菌在后發(fā)酵初期消耗氧氣制造無氧環(huán)境，產纖維素酶發(fā)酵產糖，表現為纖維素酶活上升很快、還原糖含量上升、脂肪消耗增多。當體系中氧氣消耗完全，芽孢桿菌死亡，乳酸菌開始大量增殖。耐鹽性乳酸菌代謝產生乳酸、乙酸等種類豐富的有機酸，從而使整個發(fā)酵體系酸度下降。此時，纖維素、蛋白酶均大量失活，體系中還原糖含量繼續(xù)增加，脂肪加速消耗，氨基酸氮大量產生。當酸度下降到適宜酵母菌生長繁殖的時候，耐鹽酵母便開始大量生長。酵母菌在無氧環(huán)境中消耗還原糖產生以醇類為主的各種小分子物質，醇類與酸類物質結合產生酯類物質，形成豆豉特有的風味[18]。同時，乳酸菌的生長受到高酸度與酵母菌的抑制。此時，所測理化因素達到穩(wěn)定，發(fā)酵完成。因此，微生物對于豆豉風味的形成有重要作用，為通過改變發(fā)酵菌種比例、完善風味物質提供了理論基礎。

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