曹松龍, 田亞平
(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫214122)
氨肽酶是一類(lèi)從蛋白質(zhì)或肽鏈的N端酶切氨基酸殘基的外肽酶的總稱(chēng)[1]。氨肽酶種類(lèi)繁多,不同氨肽酶對(duì)N端氨基酸殘基的水解能力不同。即使同一類(lèi)氨肽酶對(duì)不同N端氨基酸殘基的水解能力也有一定的差異。氨肽酶在食品行業(yè)、醫(yī)學(xué)研究等方面具有廣泛的應(yīng)用。在食品行業(yè),氨肽酶常被應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)的深度水解以及水解后的脫苦方面,通過(guò)氨肽酶的水解可以提高游離氨基酸的含量,改善風(fēng)味,增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;在脫苦方面,它可以避免化學(xué)試劑的使用所可能帶來(lái)的有毒物質(zhì)。其次,利用氨肽酶制備活性多肽目前也越來(lái)越普遍,并且是一種安全高效的方法。另外在醫(yī)學(xué)研究中,氨肽酶還可以作為醫(yī)療診斷用酶。
目前膜分離技術(shù)在酶制劑工業(yè)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[2-3]。膜分離技術(shù)具有物質(zhì)不發(fā)生相態(tài)變化、不消耗相變能、耗能耗質(zhì)少、效率高等特點(diǎn),可以應(yīng)用于酶的濃縮和分離過(guò)程[4-7]。采用膜分離技術(shù)不僅酶活損失小,而且操作簡(jiǎn)單,易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的放大[8-10]。作者應(yīng)用超濾技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌氨肽酶進(jìn)行一定程度的濃縮[11]及脫鹽,所得濃縮脫鹽發(fā)酵液為進(jìn)一步提取創(chuàng)造了良好基礎(chǔ)。
枯草芽孢桿菌發(fā)酵液:本實(shí)驗(yàn)室自制,并經(jīng)過(guò)離心除菌、質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%的(NH4)2SO4澄清的操作。L-亮氨酸-4-硝基苯胺 (AR),美國(guó)Alfa公司產(chǎn)品。超濾裝置:FILTECH-UF101型,上海弗立特實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;3種PES卷式超濾膜,截留分子量分別為 10、30、50 kDa;尺寸 35 mm×250 mm;有效過(guò)濾面積為0.1 m2。722型分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠制造;電熱恒溫水浴鍋,上海醫(yī)療器械五廠制造。
1.2.1 超濾方法 超濾操作包括濃縮和洗脫脫鹽兩個(gè)過(guò)程。具體操作:將發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)預(yù)處理的發(fā)酵液加到超濾系統(tǒng)中進(jìn)行濃縮,當(dāng)濃縮到一定程度時(shí),開(kāi)始定時(shí)加水洗脫,直到發(fā)酵液中的鹽基本除去,停止加水,最后再將其濃縮到合適的倍數(shù)。
1.2.2 洗膜方法 配制0.01 mol/L的NaOH溶液,在操作壓力0.15 MPa的條件下反復(fù)清洗,之后再用去離子水清洗,直到濾液澄清且膜通量恢復(fù)到98%左右為止。最后將卷式膜從超濾裝置中取出,貯存于0.01 mol/L的NaOH溶液中。
1.3.1 氨肽酶酶活測(cè)定方法 采用LNA法[12],測(cè)定時(shí),首先加入一定量的Tris-HCl緩沖液和底物(L-亮氨酸-4-硝基苯胺 L-leu-pNA),然后再加入一定量稀釋一定倍數(shù)的粗酶液,在50℃水浴反應(yīng)10 min后,405 nm比色測(cè)定酶活。酶活力定義:在50℃水浴下,每分鐘分解L-亮氨酸-4-硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol的硝基苯胺所需酶量定義為一個(gè)酶活單位。
1.3.2 膜通量測(cè)定方法 采用量筒接濾出液,同時(shí)用秒表計(jì)時(shí),最后根據(jù)結(jié)果計(jì)算出單位時(shí)間單位膜面積的流出量,即為膜通量。詳見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。
1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法 采用福林酚法[14]。
1.3.3 殘留(NH4)2SO4測(cè)定方法 采用BaCl2來(lái)檢驗(yàn)SO42-的殘留情況,進(jìn)而判斷(NH4)2SO4的去除情況。
依據(jù)先前的研究,初步確立了一種提取枯草芽孢桿菌液體氨肽酶的方法。枯草芽孢桿菌的原始發(fā)酵液,經(jīng)離心、澄清、超濾濃縮、脫鹽、醇沉后再溶解獲得液體氨肽酶。提取工藝整個(gè)流程圖如圖1所示。
圖1 提取工藝流程Fig.1 Process of the extraction
本文中主要對(duì)超濾濃縮、脫鹽過(guò)程的各種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,提高該過(guò)程酶活回收率,以及獲得相對(duì)高的膜通量。
由先前文獻(xiàn)報(bào)道,知該氨肽酶的分子量約為75 kDa[14],故選擇 10、30、50 kDa 這 3 種不同截留分子量的PES膜進(jìn)行研究。將發(fā)酵液濃縮到一定倍數(shù)后,選擇酶活回收率高且膜通量較大的這種膜,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 超濾結(jié)果Table 1 Results of ultrafiltration
由表1可知,10 kDa的PES膜過(guò)濾后酶活回收率相對(duì)較高,達(dá)到90%以上,但膜通量太小;50 kDa的PES膜膜通量最高,但酶活回收率太低;只有30 kDa的PES膜既有相對(duì)較高的酶活,又有相對(duì)高的膜通量。主要原因可能是酶蛋白質(zhì)分子本身形狀不規(guī)則,膜孔徑大小不一,酶蛋白質(zhì)分子在膜中通過(guò)率不同,從而引起酶活回收率改變以及膜通量的差異。綜上分析,選擇30 kDa的PES膜進(jìn)行超濾操作。
在超濾過(guò)程中,維持發(fā)酵液的溫度在20℃左右, 通過(guò)控制不同的操作壓力 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 MPa來(lái)分別測(cè)定酶活回收率、膜通量,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 操作壓力對(duì)酶活及膜通量的影響Fig.2 Influence of operating pressure on the activity and membrane flux
由圖2可知,酶活回收率隨操作壓力的增大而減小,而膜通量隨操作壓力的增大而增大。主要原因,一方面是當(dāng)操作壓力較小時(shí),酶分子在膜中的通過(guò)率小,酶活損失較?。浑S著操作壓力的增大,酶分子受到較大壓力的作用,在膜中的通過(guò)率增大,酶活損失也隨之增多。另一方面,隨著超濾時(shí)間的增長(zhǎng),濃差極化現(xiàn)象隨之增加,此時(shí)膜通量會(huì)顯著下降,因此要盡可能縮短時(shí)間來(lái)獲得較高的膜通量,就要選擇合適的操作壓力。綜上分析,為了既保證較高的酶活回收率,又獲得相對(duì)較大的膜通量,選擇操作壓力在0.2~0.25 MPa范圍內(nèi)[15]。
由發(fā)酵罐發(fā)酵得到的發(fā)酵液經(jīng)離心除菌、低濃度鹽的澄清后,pH值在5.6左右,另外調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至6.5、7.5。在操作壓力0.2~0.25 MPa范圍下,將這3種不同pH值的等量發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖3,圖4。
圖3 不同pH值發(fā)酵液的膜通量隨時(shí)間的變化曲線Fig.3 Membrane flux changes with time in different pH values of fermentation broth
圖4 不同pH值的發(fā)酵液酶活隨時(shí)間的變化曲線Fig.4 Enzyme activity changes with time in different pH values of fermentation broth
由圖3,圖4可知,不同初始pH值的發(fā)酵液在超濾的過(guò)程中,其膜通量以及氨肽酶活變化有一定的差異。當(dāng)發(fā)酵液初始pH值在5.6~6.5范圍時(shí),其膜通量與酶活下降較緩,整個(gè)過(guò)程中膜通量與總酶活相對(duì)較高,可能是因?yàn)椴煌琾H值的發(fā)酵液其帶電性質(zhì)與電荷的多少不一樣,若PES膜所帶電荷與酶蛋白質(zhì)分子所帶電荷相反,則易吸附酶蛋白質(zhì)分子于膜上,從而影響酶活與膜通量。綜上分析,選擇初始發(fā)酵液最佳pH值在5.6~6.5范圍內(nèi)。
隨著超濾操作[16-18]的進(jìn)行,濃差極化的現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重,于是膜表面形成濃縮的凝膠層,從而引起膜通量下降。本文中對(duì)該枯草芽孢桿菌氨肽酶的膜通量以及酶活收率隨時(shí)間的變化進(jìn)行了分析研究,結(jié)果見(jiàn)圖5。在超濾過(guò)程的前20 min,膜通量下降迅速,主要是因?yàn)殚_(kāi)始在膜表面沒(méi)有其他物質(zhì),阻力較??;隨著大分子物質(zhì)在膜表面沉淀而使阻力迅速增加。在20~60 min階段,膜通量下降相對(duì)遲緩一些,主要是膜表面的大分子物質(zhì)緩慢地加厚,阻力也緩慢地增加,且趨于穩(wěn)定。在60 min以后膜通量下降加快,同時(shí)酶活回收率也急劇下降,說(shuō)明此時(shí)膜污染較嚴(yán)重,應(yīng)立即停止超濾濃縮的操作,需要對(duì)膜進(jìn)行清洗。
圖5 氨肽酶酶活收率及膜通量隨時(shí)間的變化曲線Fig.5 Aminopeptidase activity yield and the flux change with the time
如圖6,隨著超濾的進(jìn)行,酶活回收率與膜通量都呈顯著的下降趨勢(shì),當(dāng)濃縮至3倍左右時(shí),酶活回收率在85%左右,此時(shí)膜通量也相對(duì)較高,之后急劇下降,因此選擇發(fā)酵液濃縮至3倍。
經(jīng)上述超濾濃縮之后,發(fā)酵液已濃縮到一定的倍數(shù),此時(shí)需要對(duì)該濃縮發(fā)酵液進(jìn)行洗脫進(jìn)一步脫除其中的鹽。向已濃縮過(guò)的發(fā)酵液中流加水來(lái)洗脫除鹽,直到最后將鹽基本脫除干凈。在洗脫的過(guò)程中,通過(guò)中間取樣來(lái)檢測(cè)SO42-的殘留情況,進(jìn)而判斷鹽的殘留情況,直至最后幾乎檢測(cè)不到SO42-,說(shuō)明此時(shí)鹽已基本洗脫干凈,停止流加水。綜上分析,最后確定當(dāng)所用洗脫水的體積為洗脫前濃縮發(fā)酵液體積的10倍左右時(shí),發(fā)酵液中90%以上的鹽被脫除,該脫鹽過(guò)程的酶活回收率為79%。最后以最初發(fā)酵液的體積為基準(zhǔn),將該洗脫的發(fā)酵液濃縮8~10倍,得到濃縮脫鹽發(fā)酵液,整個(gè)超濾過(guò)程酶活回收率為67.15%。
圖6 氨肽酶酶活收率及膜通量隨濃縮倍數(shù)的變化曲線Fig.6 Aminopeptidase activity yield and the flux change with the concentration ratio
在超濾操作的過(guò)程中,膜的滲透通量會(huì)因濃差極化、膜孔堵塞等原因造成膜污染而下降,可以通過(guò)定期的清洗使膜恢復(fù)其分離功能。針對(duì)膜污染的情況,作者采用0.01 mol/L的NaOH溶液對(duì)膜進(jìn)行清洗,使吸附在膜孔和表面的污染物脫落,恢復(fù)膜通量。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),清洗時(shí)間在40~50 min時(shí),膜通量基本可以恢復(fù)到98%以上,時(shí)間再長(zhǎng)膜通量不再有明顯變化。因此清洗時(shí)間確定為40~50 min。最后將PES膜液封于0.01 mol/L的NaOH溶液中,并定期更換保存液以避免長(zhǎng)菌而造成濾芯的堵塞。
采用FILTECH-UF101型超濾系統(tǒng)對(duì)枯草芽孢桿菌氨肽酶發(fā)酵液進(jìn)行超濾操作,通過(guò)對(duì)其超濾過(guò)程中操作參數(shù)的優(yōu)化,最終選擇采用截留分子量為30 kDa的 PES膜,操作壓力 0.2~0.25 MPa,發(fā)酵液初始pH 5.5~6.5,超濾濃縮倍數(shù)為3倍左右時(shí)進(jìn)行洗脫操作,洗脫水的體積為該濃縮發(fā)酵液體積的10倍左右,最終將該發(fā)酵液濃縮8~10倍。在以上最優(yōu)條件下,超濾濃縮過(guò)程的酶活回收率達(dá)85%,洗脫脫鹽過(guò)程的酶活回收率達(dá)79%,整個(gè)過(guò)程酶活回收率為67.15%,并且整個(gè)過(guò)程中膜通量維持在16 L/(m2·h)以上。
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