楊 穎， 孫文武， 周 晨， 何天龍，劉 楠， 朱蘇騏， 邵紅軍*， 段玉峰*，

（1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院；2.陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院；3.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；4.陜西師范大學(xué) 物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710062）

玉竹（Polygonatum odoratum（Mill.）Druce）是我國(guó)重要的藥食同源植物，其干燥根莖具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥，生津止渴功能，主要用于治療肺胃陰傷，燥熱咳嗽，咽干口渴，內(nèi)熱消渴[1]。它作為一種優(yōu)于參芪的滋陰、防燥、降溫和祛暑的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品已越來(lái)越受到人們的歡迎，其需求量逐年增長(zhǎng)[2]?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn):玉竹中含有多糖[1]、甾體皂苷[3]、二氫高異黃酮[4]、揮發(fā)油[5]、凝集素[6]和二肽[7]等多種成分。 其中，因玉竹水溶性多糖（POP）具有抗衰老[8]、抗氧化[9]、抗病毒[10]、降血糖[11]和增強(qiáng)免疫力[12]等多種生理功能，而POP的提取分離與結(jié)構(gòu)分析也頗受關(guān)注。Tomoda等[13]研究發(fā)現(xiàn)POP單糖組分為D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖醛酸，其摩爾比為6∶3∶1∶1.5。此外玉竹中還含有4種由葡萄糖和果糖組成的果聚糖[14]。但POP提取工藝優(yōu)化研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)中利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化POP提取工藝，將有利于玉竹活性成分及營(yíng)養(yǎng)保健機(jī)理的深入研究，同時(shí)也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)我國(guó)豐富的玉竹保健食品提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品 玉竹購(gòu)于陜西省西安萬(wàn)壽路中藥材市場(chǎng)，由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥用植物工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室鑒定為玉竹 （Polygonatum odoratum（Mill.） Druce）的干燥根莖。 1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2.1.2 儀器 U-3010 Sdetrophotometer紫外分光光度計(jì)，日本HITICHI公司制造；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司制造；DL-4C低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠制造；LGJ-18C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠制造；透析袋（分子截留量8 000～14 000）美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 POP提取率測(cè)定

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制:采用苯酚-硫酸比色法[15]。

2）POP質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定:采用苯酚-硫酸比色法和二硝基水楊酸（DNS）比色法[15]分別測(cè)定總糖和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Mp=Ms－Mr，式中:Mp、Ms和 Mr分別為 POP、總糖、還原糖的質(zhì)量（mg）。

3）換算因子測(cè)定:f=Ms/ρn，式中:f為總糖與葡萄糖的換算因子，Ms為總糖的質(zhì)量 （mg），ρ為總糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度 （mg/mL），n為總糖的稀釋倍數(shù)。

4）多糖提取率計(jì)算公式:

式中:Mo為原料的質(zhì)量（mg）。

1.2.2 提取工藝流程 參照閻欲曉等[16]的方法并有所改進(jìn):樣品粉末→熱水提取→離心過(guò)濾→取上清液→濃縮→醇沉→離心過(guò)濾→沉淀→透析→離心過(guò)濾→上清液→冷凍干燥→POP

1）樣品粉末制備:將樣品洗凈40℃烘干，粉碎過(guò)40目篩，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇10∶1 mL/g浸泡樣品12 h/次，浸泡3次，完成脫脂脫色后，40℃烘干備用。

2）水浴浸提、抽濾:將一定液料比的樣品溶液置于水浴鍋中恒溫浸提，然后4 000 r/min離心40 min，取上清液，將濾渣進(jìn)行再次浸提。

3）將2次浸提后的上清液合并，將提取液在50℃左右減壓濃縮后按乙醇終體積分?jǐn)?shù)70%加入無(wú)水乙醇沉淀[16-17]，4℃靜置24 h，4 000 r/min離心40 min得沉淀物。

4）沉淀物依次用乙醚、丙酮、甲醇各洗滌3次，蒸餾水復(fù)溶后用透析袋活水透析3 d，然后4 000 r/min離心40 min，取上清液，冷凍干燥（-40℃，真空度為0.1 MPa，干燥24 h）后即得POP。

1.2.3 提取工藝單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察了提取溫度（℃）、提取時(shí)間（h）和液料比（mL/g）3 個(gè)因子對(duì)POP提取率的影響，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4 POP提取工藝條件優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)。各因子編碼值見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表Tab.1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.5 POP的理化性質(zhì)測(cè)定 參照王應(yīng)強(qiáng)等[18]的方法測(cè)定POP的溶解性，進(jìn)行碘-碘化鉀反應(yīng)，茚三酮反應(yīng)，斐林試劑反應(yīng)，三氯化鐵反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)，紫外吸收光譜分析以0.1 mg/mL的POP溶液在190～900 nm范圍內(nèi)掃描。

1.2.6 體外抗氧化性測(cè)定

1）清除DPPH·能力:參照 Deng等[19]的方法。 每個(gè)處理重復(fù)5次。清除率計(jì)算公式為

式中，Ai為加入樣品反應(yīng)體系的吸光度；Aj為樣品溶液的吸光值；A0為空白對(duì)照反應(yīng)體系的吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

2）清除H2O2能力:參照付娟等[20]的方法。每個(gè)處理重復(fù)5次。清除率計(jì)算公式為

式中，Ai為加入樣品反應(yīng)體系的吸光度；Ao為空白對(duì)照反應(yīng)體系的吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

3）清除·OH能力:參照Chen等[21]的方法。每個(gè)處理重復(fù)5次。清除率計(jì)算公式為

式中，Ai為加入樣品反應(yīng)體系的吸光度；Aj為未加水楊酸溶液反應(yīng)體系的吸光度；A0為空白對(duì)照反應(yīng)體系的吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

4）清除 O2－·能力:采用鄰苯三酚自氧化法[22]。 每個(gè)處理重復(fù)5次。清除率計(jì)算公式為:

式中，Ai為加入樣品反應(yīng)體系的自氧化速率；Ao為空白對(duì)照反應(yīng)體系的自氧化速率。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS-13.0軟件計(jì)算半抑制濃度（IC50）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程以及POP對(duì)葡萄糖的換算因子分別為:

2.2 3種單因素對(duì)POP提取率的影響

2.2.1 不同溫度的POP提取率變化 見(jiàn)圖1（a）。在固定液料比為40∶1 mL/g，提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，隨提取溫度的上升，POP提取率不斷增加，當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)，POP提取率最高。這可能是由于在提取溫度較低時(shí)物系的傳質(zhì)過(guò)程緩慢，多糖提取率變化不大，隨著提取溫度增高其傳質(zhì)速率大，多糖提取率增大[23]?？紤]到實(shí)際情況，選擇提取溫度為90℃。

2.2.2 不同時(shí)間的POP提取率變化 見(jiàn)圖1（b）。在固定液料比為40∶1mL/g，提取溫度為90℃時(shí)，當(dāng)提取時(shí)間小于2.5 h時(shí)，POP提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間大于2.5 h時(shí)，POP提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加不明顯。這可能是由于熱水加速細(xì)胞吸水膨脹破碎，多糖溶出增多，提取率相應(yīng)增加，同時(shí)細(xì)胞的過(guò)分破碎使溶解的雜質(zhì)相應(yīng)增多，溶劑幾乎飽和，阻礙了多糖的溶解，提取率無(wú)明顯增加[24]。綜合考慮提取效率，選擇提取時(shí)間為2.5 h。

2.2.3 不同液料比的POP提取率變化 見(jiàn)圖1（c）。在固定提取溫度為90℃，提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，當(dāng)液料比小于40∶1 mL/g時(shí)，POP提取率隨液料比的增加而升高，當(dāng)液料比大于40∶1 mL/g時(shí)，POP提取率隨液料比的增加而減少。這可能由于提取過(guò)程中增加提取液的體積，一方面根據(jù)傳質(zhì)規(guī)律可以增加多糖的溶出量，另一方面也一定程度稀釋了多糖的濃度，在加一定體積倍數(shù)乙醇沉淀的過(guò)程中不利于多糖沉淀出來(lái)，兩個(gè)方面的作用分別占據(jù)主導(dǎo)地位的緣故[25]。所以選擇液料比40∶1 mL/g。

圖1 提取溫度、提取時(shí)間和液料比對(duì)POP提取率的影響Fig.1 Effects of different temperatures，times and ratios of water to raw material on extraction yield of POP（Mean±SD；n=5）

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面分析結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、提取時(shí)間和液料比3個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，研究三因素不同組合對(duì)POP提取率的影響。試驗(yàn)因素和水平及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及POP提取率的響應(yīng)曲面值Tab.2 Box-Behnken design matrix and response values for the yield of POP

利用Design Expert 7.1.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析，二次回歸擬合得到POP提取率回歸方程

式中，Y為POP的提取率，%；A為提取溫度，℃；B為提取時(shí)間，h；C為液料比，mL/g。

回歸方程項(xiàng)前系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。表中Pr＞F值表示大于F值的概率，根據(jù)P值判斷 （P<0.05），液料比（B）和提取時(shí)間（C）對(duì) POP 的提取率有顯著性影響，其余交互項(xiàng)等不顯著。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，三因素對(duì)提取率影響程度依次為:提取時(shí)間＞液料比＞提取溫度?；貧w方程的方差分析表明，相關(guān)系數(shù)平方R2=0.956 8，校正相關(guān)系數(shù)平方R2Adj=0.901 2，回歸方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有一定契合度，可以分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)；模型變異系數(shù)CV為5.23，CV值越低表明試驗(yàn)穩(wěn)定性越好[26]。綜上所述，該回歸方程可用于描述POP提取工藝的各因素與提取率間的關(guān)系。

表3 POP提取參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance of the experimental results of the POP

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面分析結(jié)果

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)，考察所擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析液料比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響[27]。 由圖 2（a）和 2（b）可知，響應(yīng)曲面的形狀均呈鞍形，相應(yīng)表現(xiàn)為曲線(xiàn)較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值沒(méi)有顯著性變化，說(shuō)明液料比對(duì)POP提取率影響較小，從等高線(xiàn)偏向的方向可知，提取時(shí)間是影響POP提取率的主要因素，提取溫度次之。由圖2（c）可知，響應(yīng)曲面的形狀呈鐘形，相應(yīng)表現(xiàn)為曲線(xiàn)較陡，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和提取溫度的升高，POP提取率先增高后緩慢下降，在提取時(shí)間為2 h，提取溫度90℃左右，POP提取率達(dá)最大值。

圖2 提取時(shí)間、提取溫度及液料比對(duì)POP提取率的響應(yīng)曲面與等高線(xiàn)Fig.2 Response surface plot and contour plots showing the effect of extracting temperature，time and ratio of liquid to solid on extraction yield of POP

2.5 POP提取工藝條件的確定

通過(guò)軟件Design-Expert 7.1.6分析得出最優(yōu)提取工藝條件為:液料比為35∶1，提取溫度為88.35℃，提取時(shí)間為2.24 h，此時(shí)POP的提取率理論預(yù)測(cè)值為8.47%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，同時(shí)又達(dá)到節(jié)省時(shí)間與能耗并取得最佳效果的目的，將POP的提取工藝條件修正為:液料比35∶1，提取溫度88℃，提取時(shí)間為2.2 h。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用修正條件進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得出POP的實(shí)際提取率為（8.46±0.02）%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。因此，利用響應(yīng)曲面分析法得到的POP提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.6 POP理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

POP為白色絮狀固體，無(wú)臭無(wú)味，易溶于水，難溶于丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑；與碘-碘化鉀反應(yīng)不顯藍(lán)色，說(shuō)明POP是非淀粉類(lèi)多糖；菲林試劑反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)和雙縮脲反應(yīng)均為陰性，說(shuō)明POP不含單糖、多酚和蛋白質(zhì)；由圖3可知，在195 nm處具有明顯的多糖吸收峰（POP質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，A195nm=0.274），在波長(zhǎng)260 nm和280 nm處無(wú)蛋白質(zhì)和核酸吸收峰，表明POP主要成分為多糖，不含蛋白質(zhì)、多肽和核酸。

圖3 POP的紫外全波長(zhǎng)掃描圖Fig.3 Ultraviolet spectrumgram of POP

2.7 POP體外抗氧化活性

2.7.1 清除DPPH·能力 DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的氮自由基，通過(guò)測(cè)定與自由基清除劑反應(yīng)前后吸收減弱的程度，可評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性[19]。POP 對(duì) DPPH·的清除率見(jiàn)圖 4（a）。當(dāng) POP 質(zhì)量濃度小于0.50 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率隨POP質(zhì)量濃度的變化較明顯，當(dāng)POP質(zhì)量濃度大于0.50 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率隨質(zhì)量濃度的增加緩慢增強(qiáng)，當(dāng)POP質(zhì)量濃度達(dá)到2.50 mg/mL時(shí)，對(duì) DPPH·的清除率達(dá)到（74.36±0.57）%。由圖 4（a）計(jì)算出對(duì)POP清除DPPH·清除率的IC50值為0.646 mg/mL，大于 VC 的 IC50值（0.048 mg/mL）。

2.7.2 清除H2O2能力 H2O2自身沒(méi)有什么活性，但它在細(xì)胞組織里可以產(chǎn)生·OH，從而對(duì)細(xì)胞有毒副作用[28]。POP對(duì)H2O2的清除率見(jiàn)圖4（b）。在0.20～1.20 mg/mL范圍內(nèi)，隨著POP質(zhì)量濃度的升高，清除H2O2自由基能力逐漸增加，兩者之間具有明顯的量效關(guān)系，當(dāng)POP質(zhì)量濃度達(dá)到1.20 mg/mL時(shí)，對(duì)H2O2的清除率接近100%。由圖4（b）計(jì)算出POP清除H2O2的IC50值為0.541 mg/mL，小于VC的 IC50值（0.901 mg/mL）。

圖 4 POP 和 VC 對(duì) DPPH·、H2O2、·OH 和 O2－·的清除率Fig.4 Inhibition effects of POP and ascorbic acid on （a）2，2-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical， （b）hydrogen peroxide， （c）hydroxyl free radical and（d）superoxide anion radical（Mean±SD；n=5）

2.7.3 清除·OH能力 ·OH是人體中最活潑、對(duì)機(jī)體危害較大的自由基[28]。POP對(duì)·OH的清除率見(jiàn)圖4（c）。當(dāng) POP 質(zhì)量濃度小于 11.00 mg/mL 時(shí)，對(duì)·OH的清除率隨質(zhì)量濃度的增加緩慢增強(qiáng)，當(dāng)POP質(zhì)量濃度大于11.00 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率隨POP質(zhì)量濃度的變化較明顯，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為20.00 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率接近100%。由圖4（c）計(jì)算出POP清除·OH的IC50值為10.029 mg/mL，大于VC 的 IC50值（0.238 mg/mL）。

2.7.4 清除O2-·能力 O2－·的形成是氧毒性的主要因素之一[28]。 POP 對(duì) O2－·的清除率見(jiàn)圖 4（d）。 在0.05～0.80 mg/mL范圍內(nèi)，隨著POP質(zhì)量濃度的升高，清除O2－·自由基能力逐漸增加，兩者之間具有明顯的量效關(guān)系，當(dāng)POP質(zhì)量濃度達(dá)到0.80 mg/mL時(shí)，對(duì) O2－·的清除率接近 100%。 由圖 4（d）計(jì)算出POP 清除 O2－·的 IC50值為 0.241 mg/mL，大于 VC 的IC50值（0.078 mg/mL）。

4 結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化了玉竹水溶性POP的提取工藝。玉竹水溶性POP提取的最佳提取工藝參數(shù)為:液料比35∶1，提取溫度88℃，提取時(shí)間為2.2 h。在此優(yōu)化條件下，玉竹水溶性POP實(shí)際提取率為（8.46±0.02）%。

動(dòng)物機(jī)體在新陳代謝的過(guò)程中，O2－·、·OH、H2O2等自由基的消除主要依賴(lài)于機(jī)體完整的抗氧化防御系統(tǒng)的預(yù)防性或阻斷性控制。促進(jìn)或增強(qiáng)自由基的消除，可通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化物及其降解產(chǎn)物的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。以清除自由基的效率等項(xiàng)目為檢測(cè)指標(biāo)，從離體或整體水平上來(lái)衡量多糖抗氧化作用的大小[28]。閻欲曉[16]等研究發(fā)現(xiàn)，不同相對(duì)分子質(zhì)量的玉竹多糖對(duì)自由基清除能力是不同的，質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%醇沉多糖對(duì)O2－·和·OH的抑制效果最好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，POP對(duì)DPPH·、H2O2、·OH 和 O2－·自由基均有一定的清除活性，相比之下對(duì)H2O2清除活性尤其明顯，而且相同質(zhì)量濃度下POP對(duì)H2O2的清除活性明顯高于VC。

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）是機(jī)體內(nèi)相關(guān)的抗氧化酶，其活力高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力，丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）氧化形成的終產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)MDA的水平可直接反映機(jī)體脂質(zhì)受活性氧自由基攻擊的損害程度[28]。單穎等[8-9，12]研究發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖能通過(guò)提高衰老模型小鼠血清SOD活性，增強(qiáng)其對(duì)自由基的清除能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，降低丙二醛含量，從而減輕對(duì)機(jī)體組織的損傷以延緩衰老；同時(shí)玉竹多糖可明顯改善衰老模型小鼠的細(xì)胞及體液免疫功能，提高胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，增加脾T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)和CD8+細(xì)胞的數(shù)量，恢復(fù)CD4+/CD8+比值的失衡狀態(tài)，從而延緩機(jī)體的免疫衰老。謝建軍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖預(yù)處理呈計(jì)量依賴(lài)性地降低糖尿病大鼠血糖濃度和胰腺組織MDA含量，增強(qiáng)SOD、GSH-Px、CAT活性。以上研究結(jié)果提示玉竹多糖的抗氧化作用可能是其免疫調(diào)節(jié)和降血糖的作用機(jī)制之一。

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