馮曉敏 ， 秦　超

(1．廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧　530021；　2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧　530021)

腦血管病是指由于栓塞和血栓形成導(dǎo)致的血管腔閉塞、血管破裂、血管壁損傷或通透性發(fā)生改變、凝血機(jī)制異常、血液黏度異?；蜓撼煞之惓Ｗ兓鸬哪X功能障礙，其發(fā)病率、病死率和致殘率均很高。目前，世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計全球腦血管疾病每年死亡人數(shù)為615萬，位列全球十大死因第二，僅次于心血管疾病。因此在對腦血管疾病進(jìn)行有效治療的同時，積極開展對腦血管病的預(yù)防至關(guān)重要。目前可以用各種血液中的生物標(biāo)志物來診斷感染、血脂異常、糖尿病和急性心肌梗死等，然而，沒有特定的血液標(biāo)志物可用于腦血管疾病的預(yù)測或診斷。細(xì)胞膜微粒(microparticles, MPs)是在細(xì)胞激活或者凋亡的情況下從細(xì)胞膜脫落下來的0.1～1 μm的微小碎片[1]。循環(huán)血中的MPs可以來自于血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞等[ 2, 3]。大量研究已報道，腦血管病發(fā)生主要源自于內(nèi)皮功能障礙、血管損傷及炎癥反應(yīng)[4]。其中內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致血栓形成是動脈粥樣硬化和腦卒中發(fā)生的一個關(guān)鍵因素，同時內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙是由內(nèi)皮細(xì)胞活化或凋亡的程度所決定的。目前已有研究報道循環(huán)血中的內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒在內(nèi)皮功能障礙、血管損傷、炎癥反應(yīng)和血栓形成中起著重要的作用，因此，推測循環(huán)血中的內(nèi)皮細(xì)胞膜微?？赡艹蔀槟X血管疾病的潛在的生物學(xué)標(biāo)記物。本文將對當(dāng)前關(guān)于循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒對腦血管病的研究做以下綜述。

內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒(endothelial microparticles， EMPs)是內(nèi)皮細(xì)胞在多種刺激下激活或者凋亡時從細(xì)胞膜脫落到外周血中的小囊泡狀物質(zhì)[5]。1990年Hamilton等[6]將補(bǔ)體蛋白C5b-9和鈣離子載體A23187作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，第一次用流式細(xì)胞儀檢測出一種<1 μm 的微粒，命名為 EMPs。保留其前體細(xì)胞特有的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，在大小和組成上與其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如凋亡體(1500～4000 nm)和外染色體(50～100 nm)不同[7-9]。許多研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血中的內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒的增加可見于多種疾病，如冠心病、多發(fā)性硬化、惡性高血壓、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂抗體綜合征、血栓性血小板減少性紫癜、鐮狀細(xì)胞病和陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)等[10-12]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)在慢性阻塞性肺病、阿爾茲海默病等疾病中也有EMPs水平的增高[13, 14]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞膜微?？赡艹蔀槎喾N疾病的新型生物學(xué)標(biāo)志物，對疾病的預(yù)測、進(jìn)展及預(yù)后有著重大的指導(dǎo)作用，進(jìn)而可能為疾病的預(yù)防、治療及防治并發(fā)癥提供重要的線索。

1　EMPs的形成機(jī)制

研究表明，正常健康人體循環(huán)血中有少量的EMPs。在多種疾病狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞膜受某些因素的刺激， 會增加EMPs釋放。這些刺激因素包括：①促炎癥刺激：TNF(腫瘤壞死因子)-α、LPS(在脂肪酸的存在下)、IL-1α、和CRP(C-反應(yīng)蛋白)等[15, 16]；②凝血因子：凝血酶和纖溶酶原激活物抑制劑等[17]；③尿毒癥的毒素：P-甲酚[18]；④其他刺激血管的因素：如高血糖、血管緊張素II、生長因子剝奪和活性氧自由基(ROS)等[5, 19-22]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)血流剪切力與EMPs的形成也有關(guān)系，但在體外實(shí)驗(yàn)中未見報道。當(dāng)前在體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究中已證實(shí)EMPs在內(nèi)皮細(xì)胞活化和凋亡時均可形成，然而，EMPs在體內(nèi)的形成機(jī)制仍待有力的證據(jù)證明。

1.1內(nèi)皮細(xì)胞活化EMPs形成首先需要細(xì)胞出芽形成膜小泡，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞激活時，胞質(zhì)中鈣離子濃度增加，使細(xì)胞膜脂類分布有關(guān)的酶的活性降低，改變膜脂正常的不對稱性，同時抑制磷酸酶，激活鈣蛋白酶，使踝蛋白降解導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂和重組，導(dǎo)致位于細(xì)胞膜內(nèi)層的磷脂酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面，細(xì)胞骨架水解，使EMPs釋放[23]。

1.2內(nèi)皮細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞產(chǎn)生EMPs與激活時的機(jī)制有所不同，細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)是細(xì)胞固縮及DNA的降解。囊泡的形成依賴于細(xì)胞骨架的肌動蛋白與肌球蛋白的相互作用，Capsase 3介導(dǎo)的Rho激酶I的激活能調(diào)節(jié)這個作用[24]。ROCK蛋白被與GTP結(jié)合的Rho蛋白激活，促進(jìn)肌球蛋白輕鏈的磷酸化，肌球蛋ATP酶激活使肌球蛋白-肌動蛋白絲與細(xì)胞質(zhì)膜連接，且收縮力增加，使細(xì)胞收縮[25]，DNA降解，DNA片段從細(xì)胞核區(qū)域裂解到膜囊泡中，EMPs釋放。由此得知，細(xì)胞凋亡所形成的EMPs可能含有細(xì)胞核的成分。他汀類藥物能通過使Rho/ROCK途徑失活，抑制EMPs的產(chǎn)生[26]。

內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒在內(nèi)皮細(xì)胞活化及凋亡時所形成的機(jī)制不同，這也表明其生物學(xué)意義可能也不盡相同。

2　 細(xì)胞膜微粒的檢測方法

目前，盡管循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒已被證實(shí)在多種病理情況下的數(shù)量有明顯改變，很多研究也在體外實(shí)驗(yàn)中提取分離出了EMPs,但是其可靠的識別和量化技術(shù)仍然是一個挑戰(zhàn)。

目前使用最多的方法是流式細(xì)胞學(xué)，先通過離心獲取乏血小板血漿，再按一定的倍數(shù)稀釋，加入高特異性熒光標(biāo)記抗體結(jié)合微粒上特定的蛋白抗原成分(EMPs表面表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞膜表面抗原，如CD31、CD144 、CD51、CD54、CD106、CD146、CD105、CD62E和CD42等)或加入annexin V結(jié)合暴露的磷脂酰絲氨酸，通過檢測結(jié)合樣本的熒光強(qiáng)度即可達(dá)到對樣品中的微粒進(jìn)行定量的目的。根據(jù)研究者不同的研究目的，選擇不同的特異性抗體，常用的抗體有：單抗CD144、 CD51、CD105、CD54、CD62E和CD106或組合抗體CD31/CD42b(內(nèi)皮細(xì)胞及血小板均表達(dá)CD31，而CD42b只在血小板表面表達(dá))和CD31/AV等。EMPs的大小通常由1 μm 和2 μm的流式細(xì)胞磁珠進(jìn)行校準(zhǔn)。

在體外細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)皮細(xì)胞在凋亡和激活過程中釋放不同抗原表型的EMPs，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時，表達(dá)結(jié)構(gòu)性標(biāo)志的抗體(如 CD31、CD51、CD105)明顯升高(且CD31>CD105)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活時，表達(dá)可誘導(dǎo)標(biāo)志的抗體 (CD54、CD62E、CD106)明顯升高(且CD62E>CD54>CD106)，annexin V與暴露于細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，因此annexin V+ EMP在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及激活時都顯著升高。因此用流式細(xì)胞學(xué)法特異性抗體可了解內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)，以便為臨床提供有用的信息。

流式細(xì)胞術(shù)作為目前檢測微粒的一項(xiàng)重要技術(shù)，具有檢測設(shè)備簡單、周期短、可同時檢測微粒所表達(dá)的兩種或多種抗原成分及易于對微粒進(jìn)行定量、能快速檢測大量的樣本等優(yōu)點(diǎn)。然而，這一技術(shù)也并非十全十美，在微粒的檢測過程中仍存在諸多不足。如EMPs非常小，所帶的表面抗原蛋白又是很小的一部分，因此，與抗體結(jié)合有一定的限制性，大大減少了被測定EMPs的數(shù)量。但目前為止，流式細(xì)胞術(shù)仍然是最普遍的檢測方法。其他檢測EMPs的方法還有：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、功能性分析、細(xì)胞微粒的氟硼二吡咯-馬來酰亞胺染色法、以細(xì)胞微粒蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的分析法、激光共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡和納米微粒跟蹤分析等[27, 28]。

3　內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒與腦血管疾病的關(guān)系

3.1EMPs與腦血管內(nèi)皮功能障礙 腦血管內(nèi)皮功能障礙為腦血管病發(fā)病的重要因素，EMPs又是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的誘導(dǎo)因素之一，因此，研究EMPs對內(nèi)皮細(xì)胞的破壞機(jī)制和理解腦血管病的發(fā)生以及預(yù)防有重大的意義。

Brodsky等[29]首次報道EMPs可減弱乙酰膽堿介導(dǎo)的血管舒張，減少小鼠主動脈NO的釋放,增加O2-(超氧陰離子)的產(chǎn)生，且這些效應(yīng)與EMPs的濃度呈正相關(guān)。NO在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞各種功能中起著重要作用，內(nèi)皮NO合酶作用改變及NO生成減少及超氧化物的產(chǎn)生均導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙?？赡軝C(jī)制為：EMPs通過使一氧化氮合酶解偶聯(lián)，使其功能從生產(chǎn)NO的酶變?yōu)楫a(chǎn)生超氧化物的NADPH氧化酶， 使NO減少，O2-和H2O2增加[20, 29]。EMPs也已被證明可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，進(jìn)一步破壞內(nèi)皮細(xì)胞。

3.2EMPs與動脈粥樣硬化 目前認(rèn)為動脈粥樣硬化的形成是由于血管內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應(yīng)相互作用引起的一個動態(tài)的、進(jìn)展的病理過程，是血管炎癥后損傷的一種表現(xiàn)[30]。EMPs可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能紊亂而分泌多種炎癥因子，同時在其表面表達(dá)黏附分子，可結(jié)合白細(xì)胞和單核細(xì)胞等并促進(jìn)其向內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。當(dāng)白細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮后會分泌更多的炎癥介質(zhì)，同時攝取氧化低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞，使病灶逐步發(fā)展，以致形成脂紋和纖維斑塊，最終導(dǎo)致粥樣硬化斑塊形成。現(xiàn)有研究報道，從人動脈硬化斑塊衍生出的細(xì)胞膜微粒還可以通過促使內(nèi)皮功能失調(diào)及內(nèi)部斑塊的促凝活性和新生血管形成，進(jìn)而促進(jìn)動脈硬化的形成[31]，由此形成惡性循環(huán)，增加粥樣硬化的不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致斑塊破裂，發(fā)生腦血管事件。

3.3EMPs與急性缺血性腦卒中缺血性腦卒中為腦部血液循環(huán)障礙，腦組織缺血、缺氧所導(dǎo)致局限性腦組織缺血壞死或軟化、神經(jīng)功能受損的疾病，包括腦梗死及腦栓塞。EMPs促進(jìn)缺血性腦卒中發(fā)病的可能機(jī)制為：內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒的表面有大量的磷脂酰絲氨酸，這種陰離子磷脂是最有效的組織因子啟動劑，激活因子Ⅶa及凝血級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血栓的形成，進(jìn)而發(fā)生缺血性腦卒中事件。

Simak等[32]研究報道，EMPs的數(shù)量在急性缺血性腦卒中的患者中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人及有腦血管病高危因素的人群，而且EMPs的數(shù)量與腦缺血的程度、面積及患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。隨后Keun-Hwa等[4]研究發(fā)現(xiàn)，CD62E+EMPs比其他表型的EMPs的數(shù)量對急性腦梗死體積及NIHSS評分有著更顯著的關(guān)聯(lián)。上文指出內(nèi)皮細(xì)胞激活時釋放CD62E+EMP，因此推測，在急性缺血性腦卒中誘導(dǎo)梗死后反應(yīng)的主要因素來源于內(nèi)皮細(xì)胞的活化而非凋亡[33]，同時表明內(nèi)皮細(xì)胞的活化是一個病理過程，而非修復(fù)過程。隨后的動物實(shí)驗(yàn)研究報道循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒和內(nèi)皮祖細(xì)胞膜微粒的數(shù)量與糖尿病鼠的血糖濃度以及腦梗死面積呈正相關(guān)關(guān)系[3]，也證明了EMPs與腦梗死面積的關(guān)聯(lián)。以上研究表明，EMPs可能為判斷急性缺血性腦卒中患者的腦缺血程度、梗死面積及臨床預(yù)后的重要血液標(biāo)記物。

3.4EMPs與顱內(nèi)外動脈狹窄 Keun-Hwa等[4]研究報道，有腦血管病致病危險因素的患者中，顱外動脈狹窄的患者CD62E+EMPs數(shù)量顯著升高，而顱內(nèi)動脈狹窄的患者CD31+/CD42-和CD31+/AV+EMPs數(shù)量顯著升高。因此，患者血液中的CD62E+EMPs與CD31+/CD42b-EMPs或CD31+/AV-EMPs的比例可用來區(qū)分顱外和顱內(nèi)動脈狹窄。從研究中也可看出，顱外動脈狹窄主要的病理改變?yōu)閮?nèi)皮細(xì)胞激活，而顱內(nèi)動脈狹窄主要為內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。因此循環(huán)中的內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒的多種不同的抗原表型在腦血管病中有著不同的生物學(xué)意義，可為及時的診斷、臨床風(fēng)險的評估、治療方式的選擇及預(yù)后的評估有著重要的指導(dǎo)意義。

3.5EMPs與血管重塑血管結(jié)構(gòu)的改變即血管重塑是高血壓病、糖尿病、動脈粥樣硬化的重要特征[34-36]。當(dāng)血管腔橫斷面積變小及血管壁增厚時，這種重塑被稱為向內(nèi)重塑，其可以用血管壁層和管腔的面積比的增加來反映[34, 37]。 腦動脈血管的向內(nèi)重塑可能會增加缺血性腦卒中的風(fēng)險及腦部的缺血性損害。最近的一項(xiàng)研究展示，升高的內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒與頸部的向內(nèi)重塑可能存在正相關(guān)的關(guān)系[38]。也有研究發(fā)現(xiàn), 人乳脂球表皮生長因子VIII(MFG-E8)可作為動脈壁老化、向內(nèi)重塑的生物標(biāo)志物， 而MFG-E8正是內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒重要的組成部分。但目前循環(huán)細(xì)胞膜微粒與大腦動脈血管重塑的潛在機(jī)制仍然未明確?？赡軝C(jī)制為：一氧化碳合酶(eNOS)在血管中扮演著重要角色，并且可以調(diào)節(jié)血管的大部分功能[39，40]。未耦合的一氧化氮合酶可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)以及高血壓或動脈粥樣硬化[41]，可使血管內(nèi)向重塑。

3.6EMPs與治療 目前有研究表明，將與正常細(xì)胞膜微粒共培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞注射到缺血性腦卒中的小鼠后，減少了小鼠的缺血性損傷，而這種效益卻在與糖尿病小鼠中提取的MPs共培養(yǎng)的EPCs中減少或消失。因?yàn)閬碜杂谡Ｐ∈蟮难h(huán)內(nèi)皮細(xì)胞膜微?？梢酝ㄟ^PPARα/NF-kB/Akt路徑促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化以及血管再生[42]。也有研究表明,激活血小板及血小板微粒含有多種至關(guān)重要的生長因子和營養(yǎng)因子,并可能成為受損神經(jīng)修復(fù)和血管再生的新的治療藥物。可能機(jī)制為：血小板及其微顆?？梢酝ㄟ^刺激內(nèi)源性干細(xì)胞(eNSC)的增殖、遷移和分化促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生,通過從內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的神經(jīng)源性信號刺激血管生成。表明血小板微粒具有增強(qiáng)血管再生、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)的作用，可改善中風(fēng)后的功能障礙[43]。EMPs是否有同樣的效益，還有待于將來的研究所證實(shí)。因此細(xì)胞膜微粒有可能成為治療腦血管疾病的一個靶點(diǎn)[44]。這為腦血管病的治療又提出了一個新的方案，但如何應(yīng)用于臨床之中，還有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，一方面，EMPs可能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能損害，另一方面，也是有內(nèi)皮細(xì)胞損害而形成和釋放的產(chǎn)物。一方面，內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒可能誘導(dǎo)腦血管疾病，另一方面，也可能是由腦血管疾病應(yīng)答所產(chǎn)生的。EMPs在內(nèi)皮功能紊亂、炎癥反應(yīng)、血栓形成及血管生成中起著重要的作用，研究也表明EMPs在腦動脈粥樣硬化形成、急性缺血性腦卒中、腦血管狹窄及腦血管重塑中扮演著重要的角色。EMPs可能成為預(yù)測腦血管疾病的新的生物學(xué)標(biāo)記物，對腦血管病的預(yù)防、治療及評估預(yù)后有著重要的臨床意義。同時，生理狀態(tài)下的EMPs可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化，可能成為治療腦血管病的新的治療措施。但目前EMPs對腦血管損害的機(jī)制還未完全明確，如何將其應(yīng)用于腦血管疾病的診療過程中還有待于今后的進(jìn)一步研究。

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