張　莉

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津　300070)

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)是一種天然酸性黏多糖，屬生物高分子化合物。CS有A、C和D三種異構(gòu)體，以A和C異構(gòu)體居多，其均由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1，3-糖苷鍵結(jié)合的雙糖為基本單位聚合而成。只是硫酸基團(tuán)的位置不同，前者為4位，后者為6位。目前CS主要是從豬、?；蝓忯~等動(dòng)物的喉骨和鼻中骨等軟骨中提取，其相對(duì)分子質(zhì)量10 000～50 000。CS用途廣泛，主要用在治療神經(jīng)性頭疼、偏頭痛、骨關(guān)節(jié)疾病、冠心病和心絞痛，對(duì)鏈霉素引起的聽覺障礙具有顯著的臨床效果。近年來有關(guān)硫酸軟骨素與氨基葡聚糖、玻璃酸鈉等藥物聯(lián)合使用[1，2]治療骨性關(guān)節(jié)炎的報(bào)道越來越多，制成復(fù)方制劑后其抗炎、鎮(zhèn)痛效果更加顯著。隨著對(duì)CS生理功能及其理化性質(zhì)的進(jìn)一步深入研究，在醫(yī)藥制劑、日用產(chǎn)品、醫(yī)藥材料、保健品等領(lǐng)域，CS的用途將更加廣泛，越來越引起人們的重視[3]。

1　我國(guó)現(xiàn)行的法定測(cè)定方法的應(yīng)用情況[4，5]

現(xiàn)執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4，5]中硫酸軟骨素含量測(cè)定方法主要分為三類，即Elson-Morgan比色法、咔唑比色法和酶解-高效液相色譜法。

1.1測(cè)定氨基己糖的Elson-Morgan比色法早在1989年，CS的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)即收載于《衛(wèi)生部藥品》標(biāo)準(zhǔn)生化藥品第一分冊(cè)。后此標(biāo)準(zhǔn)又收入于1998年頒布的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》二部第六分冊(cè)。該法的測(cè)定原理是先將CS酸水解成氨基葡糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng)，再與對(duì)二甲氨基苯甲醛進(jìn)行衍生顯紅色，在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,以鹽酸氨基葡糖作對(duì)照品,計(jì)算氨基葡糖含量,進(jìn)而換算成CS的含量。因此方法使用的對(duì)照品和酸水解后的產(chǎn)物有所不同，故不能真實(shí)的反映其主體結(jié)構(gòu)的真實(shí)含量，準(zhǔn)確度較低，結(jié)果重現(xiàn)性不好。

1.2測(cè)定葡萄糖醛酸的咔唑比色法該法收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(第九冊(cè))，用于測(cè)定多種CS制劑。該法的測(cè)定原理是利用硫酸軟骨素中的D-葡糖醛酸在飽和硼酸溶液和四硼酸鈉硫酸溶液的共同作用下加熱生成糠醛，在0.2%咔唑無水乙醇溶液中進(jìn)一步加熱顯紅色，顯色后的溶液在520 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收,測(cè)定時(shí)以葡糖醛酸為對(duì)照品。該法因需要水解和顯色，實(shí)驗(yàn)過程較為煩瑣、復(fù)雜，而且干擾因素較多。操作過程中使用硫酸，也給操作者帶來諸多不便。雖然準(zhǔn)確度有所提高，但專屬性仍然不是很好。

1.3酶解-高效液相色譜法2010年版的《中國(guó)藥典》[6]采用了酶解-高效液相色譜法，用于測(cè)定 CS鈉原料、片劑和膠囊劑。采用強(qiáng)陰離子交換硅膠為填充劑的色譜柱，分別以水(pH 3.5)和2 mol/L氯化鈉溶液(pH 3.5) 為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為232 nm。用CS鈉對(duì)照品作為對(duì)照，按外標(biāo)法以硫酸軟骨素A、B和C的峰面積之和計(jì)算含量。反應(yīng)的原理為CS 鈉在硫酸軟骨素 ABC 酶作用下，將硫酸軟骨素鈉酶解為硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C和少量硫酸軟骨素B三者的二糖單元?？蓽?zhǔn)確判斷產(chǎn)品軟骨的來源，精確地反映CS 鈉的真實(shí)含量，專屬性強(qiáng)。

2　CS定量分析方法

CS定量分析方法有許多種，每種含量測(cè)定方法均有其特點(diǎn)，但測(cè)定原理均是根據(jù)其組成的糖單位(D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖)、硫酸基以及酸性黏多糖的大分子性質(zhì)。

2.1光譜法

2.1.1分光光度法

2.1.1.1氨基己糖的測(cè)定 測(cè)定CS含量常用為Elson-Morgan反應(yīng)法，該方法不僅操作煩瑣,而且重現(xiàn)性差。

2.1.1.2已糖醛酸的測(cè)定 常用的方法為咔唑法，測(cè)定原理同前所述。萬秀玉等[7，8]建立咔唑法同時(shí)測(cè)定玻璃酸鈉和CS的含量。采用醋酸鈉調(diào)節(jié)樣品的酸堿度和離子強(qiáng)度，氯化十六烷基吡啶可選擇性使CS沉淀，而玻璃酸鈉不沉淀，從而將玻璃酸鈉和CS進(jìn)行分離。樣品預(yù)處理?xiàng)l件為：精密量取玻璃酸鈉和CS的混合溶液10 ml，加入醋酸鈉1.6 g，12.5 mmoL/L氯化十六烷基吡啶10 ml，充分?jǐn)嚢韬?，靜置1 h，20 μm濾膜過濾；濾液用于測(cè)定玻璃酸鈉的含量；濾餅經(jīng)1.4 mol/L氯化鈉溶液超聲解離后，用于測(cè)定CS的含量，玻璃酸鈉和硫酸軟骨素的平均回收率分別為101.2%和99.4%，RSD分別為1.05%和0.96%。說明本法可同時(shí)測(cè)定玻璃酸鈉和硫酸軟骨素的含量，相互之間無干擾。該法較測(cè)定氨基葡糖法簡(jiǎn)單，由于操作過程中同樣使用濃硫酸，給操作者帶來諸多不便。

2.1.1.3陽離子染料法CS在水溶液中解離帶負(fù)電荷，研究者利用這一特性分別采用一種陽離子染料吖啶橙，其在酸性條件下帶正電荷；和醌亞胺類染料中性紅，其本身也帶正電荷，兩種物質(zhì)與CS的相互作用均能形成復(fù)合物，根據(jù)其復(fù)合物溶液在特定波長(zhǎng)處隨著吸光度降低與CS的含量成比例關(guān)系的特點(diǎn)，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的測(cè)定CS含量的光度法。

李明明等[9]建立了分光光度法測(cè)定CS含量。在pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，結(jié)晶紫在583 nm處有一特征吸收峰，結(jié)晶紫是一種陽離子染料，在酸性條件下帶正電荷，結(jié)晶紫結(jié)構(gòu)中的氨基帶正電荷，CS的磺酸基和羧基帶負(fù)電荷，兩者通過靜電引力和疏水作用力形成締合物，產(chǎn)生變色效應(yīng)，吸光度降低兩者的吸光度差值與CS濃度在0.01～2.7 g/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為99.7%。據(jù)此建立了一種檢測(cè)濃度范圍較大、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便的分光光度法測(cè)定CS含量。

2.1.1.4間苯三酚分光光度法利用CS與含有間苯三酚的無機(jī)酸在100℃反應(yīng)30 min，生成的有色物質(zhì)在波長(zhǎng)558 nm處有最大吸收，通過比色測(cè)定CS的含量，該方法將水解和顯色反應(yīng)一步完成，具有較好重現(xiàn)性，操作簡(jiǎn)單。尤其適用于生產(chǎn)企業(yè)準(zhǔn)確快速檢測(cè)CS的要求，是分光光度法測(cè)定CS比較理想的方法。

2.1.1.5熒光分光光度法逯家輝等[10]根據(jù)在pH 5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，結(jié)晶紫在232.0 nm光的激發(fā)下，于467.0 nm處有一個(gè)熒光峰，結(jié)晶紫分子的氨基在酸性條件下帶正電荷，CS的磺酸基和羧基帶負(fù)電荷，二者通過靜電引力和疏水作用力形成締合物，締合物在467.0 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度差值與CS濃度在0.002～1.7 μg/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定CS含量的新方法。并同時(shí)采用維多利亞藍(lán)B分光光度法進(jìn)行了比較，所測(cè)的結(jié)果基本一致，用于CS類藥物的質(zhì)量檢測(cè)。

2.1.2化學(xué)發(fā)光方法李艷平等[11]建立快速測(cè)定CS注射液的化學(xué)發(fā)光方法。方法采用Ce4+-Na2SO3-H2SO4氧化還原體系，并利用體系中加入CS后發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)的原理，建立測(cè)定CS的化學(xué)發(fā)光分析方法，并與間苯三酚分光光度法進(jìn)行了比較。該方法不需要分光光度法中加熱等步驟，所建方法快捷、簡(jiǎn)便、靈敏度高，可用于CS注射液中CS含量的測(cè)定，若能選擇適當(dāng)?shù)妮腿》椒◤纳飿悠诽崛S，則可利用本方法進(jìn)行體內(nèi)藥物分析。

2.1.3共振瑞利散射光譜法李繼桃等[12]將CS與結(jié)晶紫相互作用生成復(fù)合物，該復(fù)合物分別在505和661 nm波長(zhǎng)處有最大共振瑞利散射峰，分別用兩種波長(zhǎng)測(cè)定了CS注射液中CS的含量。

2.2光度滴定法利用CS可以與氯化十六烷基吡啶結(jié)合在適宜的條件下形成穩(wěn)定的混懸液的性質(zhì), 徐志洲等[13]研究建立了在420 nm波長(zhǎng)處用光度電極指示終點(diǎn),快速測(cè)定CS含量的新方法。該方法可以防止生產(chǎn)廠家非法添加氨基己糖來提高CS含量的問題，是一種簡(jiǎn)而易行測(cè)定CS的檢測(cè)手段。

2.3高效液相色譜法林燕飛等[14]建立以蒸發(fā)光散射為檢測(cè)器，采用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨基葡萄糖片中CS。本方法能避免鹽酸氨基葡萄糖對(duì)CS測(cè)定的干擾,分離度大于2.0，在流動(dòng)相中加入0.1%的三乙胺，不僅促進(jìn)CS的電離平衡, 而且使CS峰形嚴(yán)重拖尾的問題得以改善，該方法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好。

潘自國(guó)等[15]建立了RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定CS總含量及其A、B、C、D 4個(gè)組分含量。采用C18柱，流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸-異丙醇 (15∶85∶1)，檢測(cè)波長(zhǎng)209 nm，柱溫40 ℃。CS總量在0.4～2 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9997)，方法平均回收率99.3%，RSD為1.16%。

狄平平等[16]建立復(fù)方氨基葡萄糖片中鹽酸氨基葡萄糖和CS含量HPLC測(cè)定方法。方法均采用C18色譜柱，鹽酸氨基葡萄糖以0.68% 醋酸緩沖溶液-甲醇(82∶18)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl。CS以0.005 mol/L辛烷磺酸鈉水溶液-乙腈(95∶5)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為195 nm；流速為0.5 ml/min；進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果鹽酸氨基葡萄糖濃度在0.5061～4.100 mg/ml范圍內(nèi)與異構(gòu)體峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為100.59%，RSD為1.21%(n=6)。CS的進(jìn)樣濃度在170.7～1001.5 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為99.87%，RSD為1.05%(n=6)。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于本品的質(zhì)量控制。

石瑞平等[17]采用離子對(duì)反相高效液相色譜法測(cè)定CS含量及有關(guān)物質(zhì)。該方法的檢測(cè)波長(zhǎng)為195 nm，已接近遠(yuǎn)紫外區(qū)，甲醇和乙腈的截止波長(zhǎng)分別為205和190 nm，故流動(dòng)相選用乙腈。同時(shí)流動(dòng)相中加入了0.004 mol/L辛烷對(duì)氨基苯磺酸鈉溶液。選用低濃度的離子對(duì)試劑使得CS的的分離效果更好而且基線穩(wěn)定，干擾少，主成分峰拖尾現(xiàn)象也得到了明顯改進(jìn)； 該法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可作為控制CS滴眼液質(zhì)量的方法。

David等[18]利用軟骨素酶ACⅡ?qū)S酶解后，也采用離子對(duì)的液相色譜法對(duì)CS的含量進(jìn)行了測(cè)定，該方法在240 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果精確度高，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)。

2.4電泳法電泳法樣品制備簡(jiǎn)單、用量小，分析時(shí)間短，可應(yīng)用于CS的定量分析。電泳測(cè)定方法包括醋酸纖維素薄膜電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和瓊脂糖凝膠電泳法等

沈建如等[19]建立了高效毛細(xì)管電泳可以快速、準(zhǔn)確地直接測(cè)定原料藥及片劑中CS含量的方法。方法采用區(qū)帶毛細(xì)管電泳為分離模式，操作電壓30 kV，毛細(xì)管溫度25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，操作緩沖液為15 mol/L磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)pH至3.0)，壓力進(jìn)樣(50 mbar×15 s)，外標(biāo)法定量。所用輔料對(duì)CS片劑的定量分析無干擾，CS的出峰時(shí)間在6.5 min左右，實(shí)驗(yàn)中電流噪音較小，分離效果良好。應(yīng)用范圍較廣?？梢詽M足實(shí)際生產(chǎn)中的檢驗(yàn)需要。

3　展望

CS是重要的生化藥物，具有多種生物活性，因其特有的生物活性而廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需要量比較大，CS的檢測(cè)方法也多種多樣，各有其特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)要求加以選擇。分光光度法操作煩瑣，重現(xiàn)性差，且干擾因素多，需經(jīng)進(jìn)一步改良，簡(jiǎn)化操作；一般的高效液相色譜法測(cè)定時(shí)由于紫外檢測(cè)為短波長(zhǎng)，基線噪音比較高，色譜峰容易拖尾；加入離子對(duì)試劑可以改善峰形，提高分離效果且基線穩(wěn)定，專屬性強(qiáng)；高效毛細(xì)管電泳專屬性強(qiáng)，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣。隨著檢驗(yàn)條件和設(shè)備的不斷進(jìn)步，大型精密儀器的不斷引進(jìn)，CS含量測(cè)定的方法也將不斷提高和完善，以滿足CS及其制劑的質(zhì)量控制的需求[20]。

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2陳磊，凌沛學(xué).硫酸軟骨素和玻璃酸鈉聯(lián)合應(yīng)用治療木瓜酶致兔膝骨關(guān)節(jié)炎[J].中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(1)33

3曹岳華，彭國(guó)慶.硫酸軟骨素在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用概況[J].中南藥學(xué)，2010，8(3)：222

4張?zhí)烀?，凌沛學(xué).硫酸軟骨素的過去、現(xiàn)在和將來[J].食品與藥品，2010，12(1)：1

5姜玉紅，張翊.硫酸軟骨素含量測(cè)定的法定方法[J].食品與藥品，2009，11(3)：68

6中國(guó)藥典[S]．二部．2010: 984-986

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8萬秀玉，姜雯.含玻璃酸鈉的復(fù)方硫酸軟骨素滴眼液中硫酸軟骨素的含量測(cè)定[J].中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(1)：43

9李明明，逯家輝.硫酸軟骨素的結(jié)晶紫分光光度法測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39(1)：50

10逯家輝，李明明.熒光法測(cè)定硫酸軟骨素含量的新方法[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(5)：561

11李艷平，吳擁軍.化學(xué)發(fā)光法快速測(cè)定硫酸軟骨素注射液的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22(3)：331

12李繼桃，李念兵.甲基紫硫酸軟骨素共振瑞利散射光譜及其應(yīng)用[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2007,26(2)：183

13徐志洲, 徐玉文.光度滴定法測(cè)定硫酸軟骨素的含量.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2008,9(6):465

14林燕飛，孫靜蕓． HPLC-ELSD法測(cè)定復(fù)方氨基葡萄糖片中硫酸軟骨素的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23(5):388

15潘自國(guó)， 陶禮萍.硫酸軟骨素的RP-HPLC測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38(9)：659-661

16狄平平，勞苑子.HPLC法測(cè)定復(fù)方氨基葡萄糖片中鹽酸氨基葡萄糖和硫酸軟骨素含量[J].中國(guó)藥事，2010，24(3)：283

17石瑞平，胡海勛.離子對(duì)反相高效液相色譜法測(cè)定硫酸軟骨素滴眼液的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2008，8(9)：1574

18David J I，Roman M．Determination of chondroitinsulfate content in raw materials and dietary supplements by highperformanceliquid chromatography with ultraviolet detection afterenzymatic hydrolysis: single-laboratory validation[J]．J AOAC Int，2007，90(3): 659

19沈建如，陳振德.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定硫酸軟骨素含量[J].中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(3)：197

20于海洲，范慧紅.硫酸軟骨素含量測(cè)定方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志,2011，32(2)：160