黃國(guó)珍 張 莉 葉國(guó)永 吳朝暉 唋長(zhǎng)順

1.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518118；2.廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東廣州 511440

我國(guó)常見(jiàn)的遺傳性血液病有很多種，其中之一就是地中海貧血病。在我國(guó)，地中海貧血病的高發(fā)地區(qū)主要集中在廣東、廣西、海南和福建等省份。在世界范圍內(nèi)保守估計(jì)[1]，有近2億人攜帶此病基因[2]，它已被世界衛(wèi)生組織列為危害人類健康的6種常見(jiàn)病之一。如果夫婦雙方都攜帶地貧基因，按照基因重組定律，他們子女就會(huì)有25%的可能是重型地中海貧血，50%的可能是輕型地中海貧血，另有25%才屬于正常。按照現(xiàn)有的醫(yī)療技術(shù)水平，尚無(wú)有效治療地貧的方法，只有通過(guò)遺傳篩查和產(chǎn)前診斷才能有效杜絕重癥地貧患兒的出生[3]。本文回顧性分析了地中海貧血病患者110例，目的是聯(lián)用MLPA技術(shù)和基因檢測(cè)技術(shù)，對(duì)地中海貧血病患者進(jìn)行基因診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年10月～2013年2月來(lái)深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院就診的地中海貧血病患者110例，其中男56例，女54例，年齡 21～56 周歲，平均（34±3.4）周歲。在110例地中海貧血病患者中，重型41例，輕型69例。

1.2 方法

1.2.1 基因測(cè)序 將目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR）擴(kuò)增，具體為，PCR反應(yīng)體系為每管10μL，提純的人體 DNA 樣本 1 μL，上下游引物各1μL，1μL 10×loading buffer，1 μL的酶，剩余量用 ddH2O 補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 2 min，（92℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s）進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。再將基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)束后觀察，拍照。

1.2.2 MLPA檢測(cè) 根據(jù)MLPA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體步驟為，PCR反應(yīng)體系為每管10 μL，提純的人體 DNA 樣本 1 μL，上下游引物各 1 μL，1 μL 10×loading buffer，1 μL 的酶， 剩余量用 ddH2O 補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 2 min，（92℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s）進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。再取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL加上甲酰胺和Ladder，加熱5 min，最后放在冰上10 min。最后進(jìn)行電泳，時(shí)間為2 h。電泳完后用相關(guān)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)110例基因進(jìn)行檢測(cè)，α1型地中海貧血病21例，α2型地中海貧血病27例，β型地中海貧血病62例。在62例β型地中海貧血病患者中，21例（33.9%）合并α型地中海貧血病雙重雜合子，41例（66.1%）是41～42雜合基因型。

2.2 MLPA檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)MLPA檢測(cè)檢測(cè)又發(fā)現(xiàn)16例（14.55%）α型地貧缺失型。因?yàn)橥ㄟ^(guò)普通的基因檢測(cè)結(jié)果所發(fā)現(xiàn)的地中海貧血病基因缺失型僅僅只能包括中國(guó)人的90%，再加上MLPA檢測(cè)，基本就能覆蓋全中國(guó)人。

3 討論

地中海貧血病屬于遺傳性疾病，主要由基因缺陷導(dǎo)致的，鑒于現(xiàn)有的醫(yī)療水平，徹底根治此病尚有難度。所有對(duì)于地中海貧血病的預(yù)防已經(jīng)受到外國(guó)的重視。所以許多發(fā)達(dá)國(guó)家例如希臘、撒丁尼亞島、意大利和塞普路斯等從20世紀(jì)70年代起采取對(duì)地中海貧血病的預(yù)防措施，如普及地中海貧血病的病例知識(shí)，加強(qiáng)實(shí)施衛(wèi)生教育、加大對(duì)地中海貧血病篩查力度等方法，很好地控制了地中海貧血病在這些國(guó)家的發(fā)病率。甚至在有些國(guó)家地中海貧血病發(fā)病率降低到了0%，比如在意大利，年輕夫婦從臨床醫(yī)生和衛(wèi)生部門(mén)學(xué)習(xí)到關(guān)于遺傳風(fēng)險(xiǎn)的知識(shí)，從而能更好地選擇生育時(shí)機(jī)，降低了地中海貧血病的發(fā)病率。亞太地區(qū)如新加坡等也是地中海貧血病的重災(zāi)區(qū)，這些國(guó)家學(xué)習(xí)歐洲先進(jìn)的預(yù)防方法和干預(yù)手段，也大大降低了地中海貧血病的發(fā)病率，已經(jīng)接近了0%。在中國(guó)，地中海貧血病高發(fā)地區(qū)是廣州，衛(wèi)生部門(mén)已對(duì)此有了高度的重視，也制定了相關(guān)的預(yù)防措施，力圖最大程度地降低地中海貧血病的發(fā)病率。

預(yù)防地中海貧血病的關(guān)鍵就是能否有效地檢測(cè)和篩查出地中海貧血病缺陷基因的攜帶者[4]。一旦準(zhǔn)確地檢測(cè)和篩查出地中海貧血病缺陷基因的攜帶者，就能指導(dǎo)他們進(jìn)行合理的婚配和生育，就能預(yù)防地中海貧血病基因缺陷的胎兒出生，所以提高地中海貧血病缺陷基因的檢測(cè)和篩查水平有重要的意義。

血紅蛋白電泳與血液學(xué)篩查是診斷地中海貧血的常用方法[5]。如用這兩種方法發(fā)現(xiàn)地中海貧血的疑似病例，就再通過(guò)基因檢測(cè)的方法確定是否為地中海貧血病基因缺陷。這一些系列的方法準(zhǔn)確度比較高，能發(fā)現(xiàn)中國(guó)人中90%的地中海貧血病基因缺失型。PCR法和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)是基因檢測(cè)中常用的兩種方法[6]。國(guó)際上檢測(cè)α型地中海貧血基因缺失的方法主要是單管多重PCR法，方法就是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系里加入多對(duì)反應(yīng)引物，大概有3～4對(duì)，這樣能同時(shí)檢測(cè)多對(duì)等位基因，一般能同時(shí)檢測(cè)出3種地中海貧血病基因缺失，但對(duì)非缺失型基因，漏檢率較高。反響雜交發(fā)能檢測(cè)β型地中海貧血病的基因突變。這種方法能在同一張膜上同時(shí)檢測(cè)17～18對(duì)等位基因的突變，大大提高了工作效率，但漏檢率也不低，所以用PCR法和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)等基因檢測(cè)的方法還存在一定的漏洞，檢測(cè)率還不能達(dá)到100%。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一種全新的檢測(cè)技術(shù)已問(wèn)世，它就是多重連接酶依賴探針擴(kuò)增法，它能在一個(gè)Eppendorf管里準(zhǔn)確地檢測(cè)40多個(gè)基因序列[7]?，F(xiàn)在已經(jīng)將此種方法引入到地中海貧血基因檢測(cè)領(lǐng)域[8]，發(fā)現(xiàn)它能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出β地中海貧血的基因缺失和α地中海貧血缺失型。

多重連接酶依賴探針擴(kuò)增法的原理是這樣的，先設(shè)計(jì)出多對(duì)與目的序列互補(bǔ)的探針，它們一般能有效覆蓋真?zhèn)€目的序列[9]。再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到40多種不同的DNA序列。最后進(jìn)行電泳分析，檢測(cè)出缺陷基因。它的強(qiáng)大之處在于能同時(shí)檢測(cè)出所有的缺陷基因。對(duì)于檢測(cè)地中海貧血缺陷基因，多重連接酶依賴探針擴(kuò)增法能同時(shí)檢測(cè)出α基因缺陷型和β缺陷型的基因[10]，而且運(yùn)用這種方法能檢測(cè)到人類所有的β珠蛋白基因（HBB）和正常的血紅蛋白基因（HbA）突變，很好地彌補(bǔ)了血紅蛋白電泳、血液學(xué)篩查和PCR法[11]、反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)這幾種方法的技術(shù)缺陷[12]。

通過(guò)本文的研究，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用基因測(cè)序技術(shù)能檢測(cè)到大部分的地中海貧血病，再聯(lián)用多重連接酶依賴探針擴(kuò)增技術(shù)能更準(zhǔn)確的檢測(cè)到全部地中海貧血病，所以聯(lián)用多重連接酶依賴探針擴(kuò)增技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)是檢測(cè)地中海貧血病有效的方法，為以后的臨床檢測(cè)提供了依據(jù)。

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