薛華麗

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

花椒籽是調(diào)味料花椒生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，其產(chǎn)量可占花椒產(chǎn)量的50%，但長期以來一直未被利用，每年有數(shù)十萬噸的花椒籽亟待開發(fā)利用。研究發(fā)現(xiàn)，花椒籽油中含有高達80%不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA)17%～24%。ALA是人體必需的脂肪酸之一，具有降血脂、降血壓、抗腫瘤、抑制衰老等重要生理功能[1-3]，尤其是從植物中提取的ALA能夠通過肝臟代謝產(chǎn)生具有“腦黃金”之稱的EPA和DHA及多種有益因子，參與生命過程，提高人體自身免疫力[4-6]。因此其開發(fā)具有極其廣闊的前景。

目前，α-亞麻酸分離富集方法有硝酸銀絡(luò)合法、分子蒸餾、β-環(huán)糊精包合法和尿素包合法等。劉靜等[7]采用β-環(huán)糊精包合法，通過正交試驗優(yōu)化分離花椒油中α-亞麻酸，使其質(zhì)量分數(shù)由19.17%提高到56.53%。楊秀芳等[8]采用尿素包合法，通過正交試驗優(yōu)化分離花椒油中α-亞麻酸，使其質(zhì)量分數(shù)由25.83%增至68.87%。楊克迪等[9]采用硝酸銀絡(luò)合萃取蠶蛹油α-亞麻酸酯，所得產(chǎn)品純度達到97.9%，收率44.3%。李婷婷等[10]、吳彩娥等[11]采用分子蒸餾技術(shù)富集獼猴桃籽油中α-亞麻酸，使其質(zhì)量分數(shù)提高到83.67%，4級分子蒸餾后α-亞麻酸質(zhì)量分數(shù)達到86.27%?？傮w來看，硝酸銀絡(luò)合法得到的亞麻酸純度高，但是硝酸銀價格昂貴，濃縮產(chǎn)品中有Ag+殘留[9]；分子蒸餾工序簡單，效率較高，但設(shè)備投入較大，要得到高純度亞麻酸需要多級分子蒸餾，回收率變低[12]。尿素包合和β-環(huán)糊精包合法具有成本低廉、工藝簡單、操作溫度低等優(yōu)點，是一種簡單有效的多不飽和脂肪酸富集方法[13-17]。本研究利用從花椒籽中提取花椒籽油為原料，采用響應(yīng)面方法優(yōu)化β-環(huán)糊精包合法富集α-亞麻酸工藝，以期使花椒籽油中α-亞麻酸得到富集純化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花椒油，產(chǎn)地廣東東莞；95%乙醇、無水硫酸鈉、石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、氫氧化鈉、濃硫酸、β-環(huán)糊精均為分析純。

DZKW電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海東星建材試驗設(shè)備有限公司；RE52-98真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市順華儀器有限公司；HP6890/5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國惠普公司；FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀 天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 花椒油中混合脂肪酸(FFA)制備

取50mL花椒籽油加入200mL 1.0mol/L NaOH-乙醇溶液中，60℃條件下皂化40min，冷卻至室溫后，加適量石油醚以除去不皂化物，置于冰箱中冷卻，使皂析出，減壓抽濾除去過量乙醇，加適量水，使皂溶解，再用10%鹽酸調(diào)至pH2～3，用石油醚萃取2次，靜置棄去水層，蒸餾水洗至中性，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾回收石油醚，即得FFA[18]。

1.2.2β-環(huán)糊精包合法處理混合脂肪酸(FFΑ)

稱取一定量β-環(huán)糊精，60℃條件下加水?dāng)嚢璞?，加入FFA與無水乙醇(2∶1，g/mL)混合溶液，一定溫度條件下攪拌至規(guī)定時間，冷卻后，置冰箱中冷凍數(shù)小時后抽濾，蒸餾水洗滌，60℃條件下干燥4h，即得白色粉末狀富集α-亞麻酸的β-CD包合物。

將此包合物置于圓底燒瓶中，加入一定量的石油醚，75℃條件下超聲回流1h，減壓抽濾，將所得濾液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚，即得富含α-亞麻酸的脂肪酸[19]。

1.2.3 脂肪酸的檢測分析

1.2.3.1 脂肪酸甲酯化

取一定量的富含α-亞麻酸的脂肪酸，加入2%硫酸-甲醇溶液，70℃條件水浴中加熱回流2h，取出冷卻，用石油醚萃取2次，合并萃取液，用飽和食鹽水洗至中性，無水硫酸鈉干燥，回收石油醚，即得可用于下述分析的α-亞麻酸甲酯。

1.2.3.2 樣品的紅外光譜分析

將β-環(huán)糊精、α-亞麻酸β-CD包合物、β-CD包合后的富含α-亞麻酸的脂肪酸甲酯，采用KBr壓片法分別測紅外光譜吸收，比較包合前后紅外區(qū)吸收的變化，判斷β-環(huán)糊精包合法分離α-亞麻酸的效果。

1.2.3.3 樣品的GC-MS分析

色譜條件：DB-23色譜柱(15mm×0.32mm，0.25μm)。升溫程序：初溫150℃，保持4min，3℃/min升至230℃，保持20min。進樣口溫度230℃。載氣He，不分流進樣，2min后打開分流閥，進樣量1.0μL。質(zhì)譜條件：四極桿溫度150℃，離子源溫度230℃，溶劑延遲時間5min，電子轟擊能70.1eV，輔助溫度280℃。

1.2.4 單因素試驗

選取水∶β-CD、包合溫度、包合時間、冷凍時間4個因素對α-亞麻酸提純率的影響進行單因素試驗，以確定最佳的包合條件。

1.2.4.1 水∶β-CD的確定

稱取FFΑ 2.0g，按照(FFΑ＋無水乙醇)∶β-CD=1∶8，β-CD 24.0g與水配成不同比例溶液，60℃條件下包合1.5h，冰箱中冷凍15h，抽濾，洗滌，干燥包合物，按照1.2.2節(jié)的實驗方法，分離得富含α-亞麻酸的脂肪酸，稱質(zhì)量，計算提純率。

1.2.4.2 包合溫度的確定

固定水∶β-CD=10∶1，按照1.2.4.1節(jié)實驗方法，其他條件不變，考察包合溫度對分離效果的影響。

1.2.4.3 包合時間的確定

固定水∶β-CD=10∶1、包合溫度60℃，按照1.2.4.1節(jié)實驗方法，其他條件不變，考察包合時間對分離效果的影響。

1.2.4.4 冷凍時間的確定

固定水∶β-CD=10∶1、包合溫度60℃、包合時間1.5h，按照1.2.4.1節(jié)實驗方法，其他條件不變，考察冷凍時間對分離效果的影響。

1.2.5 Box-Behnken試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以Design Expert 8.0分析軟件為輔助手段，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理[20]，以水：β-CD(A)、包合溫度(B)、包合時間(C)為自變量，以α-亞麻酸的提純率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗，見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Levels and factors for the response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 水∶β-CD對提純率的影響

圖1 水::β-CD對ALA提純率的影響Fig.1 Effect of water: β-CD ratio on the content of ALA

由圖1可以看出，α-亞麻酸的提純率隨水∶β-CD變化而變化，在水∶β-CD 4∶1～10∶1之間，α-亞麻酸的提純率呈增加趨勢，水∶β-CD 10∶1時，α-亞麻酸的提純率達到最大，而后隨著水用量的增加α-亞麻酸的提純率迅速下降。其原因可能是在一定的范圍內(nèi)，β-CD的濃度越大，對花椒油中飽和脂肪酸包合的效果就越好，但當(dāng)β-CD的濃度太大時，會將其中的不飽和脂肪酸也進行一定程度的包合。因此，最佳水∶β-CD的比例為10∶1。

2.1.2 包合溫度對提純率的影響

圖2 包合溫度對ALA提純率的影響Fig.2 Effect of inclusion temperature on the content of ALA

由圖2可見，在所選的溫度范圍內(nèi)，α-亞麻酸的提純率隨包合溫度的變化曲線升降明顯，緩沖區(qū)間較大，在40～60℃之間，隨著包合溫度的升高α-亞麻酸的提純率逐漸升高，60℃達到最高，而后隨著溫度的升高，α-亞麻酸的提純率又逐漸降低。因此，選取60℃為最佳的包合溫度，此時α-亞麻酸的提純率可達到22.02%。

2.1.3 包合時間對提純率的影響

由圖3可見，α-亞麻酸的提純率隨包合時間的變化較顯著，在0.5～1.5h之間，隨著包合時間的延長α-亞麻酸的提純率急劇增加，1.5h時α-亞麻酸的提純率達最高值22.34%，而后又驟然下降。因此，選取1.5h為最佳包合時間。

圖3 包合時間對ALA提純率的影響Fig.3 Effect of inclusion time on the content of ALA

2.1.4 冷凍時間對提純率的影響

圖4 冷凍時間對ALA提純率的影響Fig.4 Effect of freezing time on the content of ALA

由圖4可見，在所選取的范圍內(nèi)，隨著冷凍時間的延長，α-亞麻酸的提純率呈現(xiàn)增加的趨勢，在5～10h之間，α-亞麻酸的提純率隨冷凍時間的延長迅速增加，在10～25h之間，α-亞麻酸的提純率的增加趨于平緩，到15h時基本達到最高值，其后隨著冷凍時間的延長，α-亞麻酸的提純率變化很小。因此，選冷凍時間15h為最佳。

2.2 包合工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for responses surfaces analysis

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計共有17個試驗點，可將其分為兩類：其一是析因點，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點，共有12個點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5次，用以估計試驗誤差。

以α-亞麻酸的提純率為響應(yīng)值，經(jīng)Design Expert 8.0分析軟件對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析得到回歸方程為：Y=22.44－0.041A＋0.52B＋1.3C＋0.060AB＋0.23AC－0.065BC－0.30A2－2.12B2－1.61C2。

圖5 水:β-CD、包合溫度、包合時間交互作用對ALA提純率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of the interaction effects of water : β-CD ratio,inclusion temperature and inclusion time on the content of ALA

根據(jù)響應(yīng)面及圖中等值線的形狀分析水∶β-CD、包合溫度、包合時間3個因素對ALA提純率的影響。等值線的形狀反映交互作用的強弱，橢圓表示兩個因素之間交互作用較強，圓形則表示兩個因素之間交互作用較弱。由圖5a、5b可知因素A和B、A和C的交互作用較顯著，圖5a中，包合溫度對ALA提純率的影響在56～60℃的范圍內(nèi)，隨包合溫度的升高迅速增加，而后又有下降的趨勢。水與β-CD比例在所選定的范圍內(nèi)，對ALA提純率的影響變化不明顯。在5b圖中，水與β-CD比例在設(shè)定的范圍內(nèi)，對ALA提純率影響不顯著。ALA提純率隨包合時間的延長急劇增加，影響較為顯著。由圖5c可見，因素包合溫度和包合時間的交互作用不顯著。明顯在其增長較為平緩處取得極大值。不過，ALA提純率隨包合時間的延長迅速增加，而包合溫度對ALA提純率的影響不明顯。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

由表3方差分析結(jié)果可見，在試驗設(shè)定的區(qū)域內(nèi)，一次項和二次項對ALA提取率影響極顯著，說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的一次線性關(guān)系。交互相中水∶β-CD和包合時間影響顯著，而A和C及B和C的交互作用對響應(yīng)值影響不顯著。失擬項對應(yīng)的P=0.202(P＞0.05)，說明所得的方程與實際擬合中的非正常誤差所占比例較小，響應(yīng)值與因素之間的回歸方程擬合度較好，說明試驗具有很高的可信性和準確性。

通過Design Expert 8.0軟件分析，由響應(yīng)曲面和等高線圖以及回歸方程分析可知，ALA提純率的最佳包合條件為：水∶β-CD=9.89∶1、包合溫度63.96℃、包合時間1.32h，此時ALA提純率為22.46%。為驗證模型及回歸方程的準確性進行最佳條件下的驗證實驗，為操作方便選取水∶β-CD=9.9∶1、包合溫度64℃、包合時間1.32h，3次重復(fù)實驗結(jié)果平均值為22.42%，基本與預(yù)測值相符。因此，本模型可以較好地反映花椒籽油最佳包合的工藝條件。

2.3 樣品的紅外光譜驗證

為了驗證β-環(huán)糊精包合法對花椒油中ALA的分離效果，通過紅外光譜儀測得β-環(huán)糊精包合前后的β-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精的包合物、包合后混合脂肪酸的譜圖如圖6所示。

由圖6可知，花椒籽油分子的紅外振動受到了較大的影響，整個α-亞麻酸-β-CD包合物基本呈現(xiàn)β-CD的紅外譜圖，只是圖6b與圖6a相比，出現(xiàn)α-亞麻酸的特征色譜峰(3012.27cm-1)，由于不飽和脂肪酸進入β-CD空腔內(nèi)，形成α-亞麻酸-β-CD包合物，因而在1710.55cm-1處的C＝O吸收峰強度明顯減弱。由此說明，花椒籽油中不飽和脂肪酸可被β-CD所包合從而達到分離花椒籽油中α-亞麻酸的目的。

圖6 β-環(huán)糊精(a)、β-環(huán)糊精包合物(b)和包合后混合脂肪酸(c)的紅外光譜圖Fig.6 IR of β-CD (a), β-CD inclusion (b) and fatty acid mixed after inclusion (c)

2.4 β-環(huán)糊精包合前后花椒油中脂肪酸GC-MS分析

為了精確測定花椒油中混合脂肪酸的種類以及包合前后脂肪酸相對含量的變化，通過氣質(zhì)聯(lián)用儀分析β-環(huán)糊精包合前后的脂肪酸色譜圖，如圖7所示。

圖7 花椒油脂肪酸(a)和 β-環(huán)糊精包合后的脂肪酸(b)氣相色譜圖Fig.7 Chromatogram of the seed oil of pricklyash (a) and fatty acid sample attained by urea inclusion method (b)

通過對未處理的花椒油氣相色譜圖中各峰的質(zhì)譜分析得出花椒油中主要脂肪酸有6種，見表4，其他脂肪酸含量甚微，部分色譜峰為添加劑，本實驗不予考慮。

表4 花椒籽油脂肪酸主要成分分析Table 4 Fatty acid composition of pricklyash seed oil

如圖7b可見，經(jīng)β-環(huán)糊精包合后氣相色譜圖上出現(xiàn)4組主峰，分析其脂肪酸主要有3種：油酸、亞油酸、α-亞麻酸，見表5。

表 5 β-環(huán)糊精包合后主要脂肪酸組成Table 5 Fatty acid composition of pricklyash seed oil after β-CD inclusion

由圖7b和表5可見，經(jīng)β-CD包合后花椒籽油中脂肪酸成分主要有3種(其中保留時間為24.21min的峰為α-亞麻酸的甲酯化峰)且均為不飽和脂肪酸，主要是油酸、亞油酸、α-亞麻酸，其中α-亞麻酸的含量由包合前的4.12%提高到包合后21.35%。

3 結(jié) 論

經(jīng)過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計得出β-CD包合花椒籽油中α-亞麻酸的最佳工藝條件為，水∶β-CD=9.9∶1、包合溫度64℃、包合時間1.32h，在該條件下回歸方程分析得出：ALA提純率為22.42%；經(jīng)一次β-CD包合，氣相色譜法分析得出：花椒油中ALA的相對含量為21.35%，不飽和脂肪酸的收率為96.74%。與其他富含α-亞麻酸的植物油脂，如亞麻籽油(40%～60%)、紫蘇籽油(56.14%～64.82%)等相比，花椒籽油中α-亞麻酸相對含量較低，分離難度較大，同時，本實驗分離得到的α-亞麻酸相對含量也低于文獻[7,19]中所報道，可能是由于所購買花椒油含有添加劑，或者由花椒籽和果實同時壓榨而得，成分不單一而導(dǎo)致。其實，目前采用單一方法是很難得到高純度、高收率α-亞麻酸的。因此，可采用多種分離方法相配合，如尿素包合法與分子蒸餾法配合，吸附分離法與脂肪酶濃縮法配合等，以達到提高分離效率，適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)的目標(biāo)。

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