錢 靜，鄭光臨，馮 欽

(江南大學(xué)機械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

基于冷鮮肉脂肪氧化的糖化酶型時間-溫度指示器的研究

錢 靜，鄭光臨，馮 欽

(江南大學(xué)機械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

對3種不同加酶量的糖化酶型時間-溫度指示器(TTI)體系的動力學(xué)性能進行研究，得到3種TTI體系的活化能數(shù)據(jù)；同時對冷鮮肉的脂肪氧化動力學(xué)性能進行研究，測得其活化能及貨架壽命。根據(jù)TTI活化能與食品活化能及終點相匹配的原則，在恒溫、變溫條件下對冷鮮肉和TTI進行貨架期與指示時間的匹配性實驗。結(jié)果表明：加酶量為50?L的糖化酶型TTI可以準(zhǔn)確預(yù)測冷鮮肉的貨架壽命。

時間-溫度指示器；糖化酶；活化能；冷鮮肉；脂肪氧化

溫度對食品的品質(zhì)及儲存周期有極大的影響，時間-溫度指示劑/器(time temperature indicator/integrator，TTI)作為包裝的一部分，易于識別和觀察到與時間、溫度相關(guān)的不可逆變化，這種變化通常表現(xiàn)為機械變形或者顏色的變化。TTI是監(jiān)控產(chǎn)品時間溫度積累的有效手段，用于指示產(chǎn)品質(zhì)量信息，提示產(chǎn)品剩余貨架期[1-3]。

在國外，時間-溫度指示器已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品和藥品等溫度敏感性產(chǎn)品的儲藏。目前國內(nèi)對TTI的研究還處于起步階段，沒有實現(xiàn)TTI的商業(yè)化，科研機構(gòu)對TTI有少量研究，且大多集中在酶型。吳秋明[4]研制出一種脲酶型TTI，隨著pH值的升高，該TTI能夠呈現(xiàn)出從初始黃色到終點紅色的變色過程。蔡華偉[5]、Sun Yan[6]等研究了一種基于淀粉酶反應(yīng)的時間-溫度指示器。其基本工藝為將淀粉與碘液混合變色后烘干粉碎，然后與淀粉酶混合壓制成片。由于這種指示卡缺乏激活裝置，制好即開始反應(yīng)，需要在冷藏條件下貯存。寧鵬[7]開發(fā)了堿性脂肪酶型時間-溫度指示卡，利用的是堿性脂肪酶與底物三乙酸甘油酯的水解反應(yīng)。

在4℃條件下，蔡華偉[5]、Sun Yan[6]研究的淀粉酶型TTI可指示的食品貨架期在2～10個月范圍內(nèi)，屬于長期監(jiān)測；而寧鵬[7]研究的堿性脂肪酶型TTI在4℃條件下的監(jiān)測時間則只有60h，吳秋明[4]研究的脲酶型TTI在5℃條件下的監(jiān)測時間約為80h，指示時間均比較短。針對于此，本研究研制的時間-溫度指示器應(yīng)用于0～4℃條件下，貯藏時間在5d左右的產(chǎn)品，如冷鮮肉。根據(jù)時間-溫度指示器與產(chǎn)品的匹配原則，首先對TTI和冷鮮肉的動力學(xué)特性進行研究，測定其活化能并進行匹配；然后在恒溫、變溫條件下，對冷鮮肉和TTI進行實驗，以驗證TTI反應(yīng)終點與食品貨架壽命終點的匹配性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精選豬扒(里脊)冷鮮肉 華潤萬家有限公司。

糖化酶(100000U/mL) 江蘇銳陽生物科技有限公司；麥芽糊精 羅蓋特精細化工有限公司；三氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-硫代巴比妥酸、氯仿、碘、碘化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YC-300L型科研、醫(yī)療保存箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；JYC-21ES10型電磁爐 九陽股份有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；PQX型多段可編程人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司；HY-4型調(diào)速多用振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖化酶型時間-溫度指示器動力學(xué)研究

為滿足不同產(chǎn)品的指示要求，對3種不同加酶量的時間-溫度指示器的動力學(xué)性能進行研究，使該糖化酶型時間-溫度指示器成為一個系列[8]，可滿足不同運輸溫度、時間的要求。3種TTI的編號及加酶量分別為1#TTI加酶量30?L、2#TTI加酶量50?L、3#TTI加酶量75?L。

取9支試管，各加入10mL、40g/L的麥芽糊精，3mL、1g/L的碘液，及不同加酶量的糖化酶，每3支作為1組，分別放置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)，每隔一段時間測1次吸光度，繪制吸光度隨時間變化的曲線。

通過測定所研制糖化酶時間-溫度指示器在不同溫度條件下的吸光度-時間曲線，并對曲線進行擬合，可以得到時間-溫度指示器在不同溫度條件下的反應(yīng)速率，然后根據(jù)Arrhenius方程[16]，求得TTI反應(yīng)體系的活化能，從而確定時間-溫度指示器的適用范圍。

1.3.2 冷鮮肉氧化動力學(xué)參數(shù)的確定

指征冷鮮肉新鮮程度的指標(biāo)有多種，常見的有：菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)、pH值、2-硫代巴比妥酸(TBA)等[9-10]。這些指標(biāo)互相印證，均可從某個側(cè)面反映冷鮮肉的新鮮程度[11-12]。本實驗采用TBA值法(2-硫代巴比妥酸實驗法)來評價肉類的脂肪氧化程度。反應(yīng)原理是：不飽和脂肪酸經(jīng)氧化分解會產(chǎn)生丙二醛等衍生物，與TBA發(fā)生顯色反應(yīng)，通過測定反應(yīng)產(chǎn)物在532nm和600nm波長處的吸光度，可以計算出相應(yīng)的TBA值[13]。隨著脂肪氧化程度的加劇，氧化產(chǎn)物增多，TBA值也會相應(yīng)地增大，因此可以通過測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度來定量脂肪的氧化程度。

測定方法：準(zhǔn)確稱取絞碎肉樣l0g，置于100mL錐形瓶中，加入50mL、7.5g/100mL的三氯乙酸溶液(0.1g/100mL EDTA)，振蕩器振搖30min，雙層濾紙過濾含肉樣的乳白色混合液(為保證過濾干凈，需重復(fù)過濾)；用5mL移液管移取濾液5mL于25mL帶塞試管中，加入0.02mol/L的TBA溶液5mL，加塞后搖勻；置于沸水中煮40min，取出后靜置冷卻至室溫；取上清溶液于25mL試管中，加5mL氯仿后搖勻，靜置會出現(xiàn)分層；吸取上清溶液于比色皿中，分別在波長532nm和600nm處測吸光度，并根據(jù)式(1)[14-15]計算TBA值：TBA值/(mg/kg)=(A532nm－A600nm)/155×0.1×72.6×100(1)式中：A532nm和A600nm分別代表上清溶液在波長532nm和600nm處的吸光度。

為測定冷鮮肉在不同溫度條件下的脂肪氧化速率，將分裝好的10g裝冷鮮肉小樣分別置于不同溫度的恒溫箱中，每隔一定時間分別對其進行TBA值的測定。

1.3.3 糖化酶型時間-溫度指示器與食品的匹配原則

適用性是評價TTI能否指示食品質(zhì)量時要考慮的重要問題。一種TTI不可能適用于所有的產(chǎn)品，必須有針對性地為不同的食品選擇相應(yīng)的指示器。符合匹配原則方可將TTI應(yīng)用到相應(yīng)產(chǎn)品上。TTI預(yù)測食品貨架壽命的匹配原則如下：TTI反應(yīng)的終點與食品貨架壽命的終點相吻合；TTI與食品的活化能差值小于25kJ/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖化酶型時間-溫度指示器動力學(xué)研究

2.1.1 各TTI體系在不同溫度條件下反應(yīng)速率的確定

在本實驗中，通過測定時間-溫度指示器在變色反應(yīng)過程中的吸光度，可以繪制出3種TTI在指示時間內(nèi)吸光度隨時間變化的曲線，如圖1所示。

利用數(shù)據(jù)處理軟件對吸光度-時間曲線進行指數(shù)函數(shù)擬合：

式中：X是TTI體系的吸光度；a、k及b分別是擬合函數(shù)參數(shù)。由此得到糖化酶型時間-溫度指示器在不同溫度條件下的反應(yīng)速率k，如表1所示。

圖1 不同溫度條件下1#TTI(a)、2#TTI(b)和3#TTI(cc))的吸光度與時間的關(guān)系Fig.1 Relationships between the absorbance of TTIs and reaction time at different temperatures

表1 各擬合曲線參數(shù)及相應(yīng)llnnk值Table1 The parameters of fitted curves and corresponding lnk vaalluuee

從表1可以看出，不同溫度條件下的擬合曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2都在0.99以上，說明3種TTI在不同溫度條件下的吸光度與時間的指數(shù)相關(guān)性顯著。

2.1.2 各TTI體系活化能的確定

酶催化反應(yīng)中溫度對反應(yīng)速率的影響遵循Arrhenius公式[16]：

式中：k為反應(yīng)的速率常數(shù)；k0為指前因子，對于指定反應(yīng)是一個常數(shù)；R為摩爾氣體常數(shù)，在法定計量單位中R=8.314J/(mol·K)；T為熱力學(xué)溫度/K；Ea為活化能。

以lnk對1/T作圖，若兩者線性關(guān)系顯著，說明不同溫度條件下的速率常數(shù)k符合Arrhenius方程，則可利用Arrhenius方程求出活化能Ea和指前因子k0。

圖2 各TTI的llnnk對11//T關(guān)系曲線Fig.2 The curves between lnk and 1/T for TTIs

根據(jù)表1中不同溫度條件下所對應(yīng)的lnk值，可以作出lnk與1/T的關(guān)系曲線，如圖2所示。

利用數(shù)據(jù)處理軟件，可以得到各TTI的擬合直線，利用Arrhenius方程可以求得各自的活化能Ea和指前因子k0，如表2所示。

表2 各TTI的動力學(xué)參數(shù)Table2 The kinetic parameters of TTIs

理論研究表明，當(dāng)TTI的活化能與產(chǎn)品的活化能相差在25kJ/mol之內(nèi)時，該TTI便可應(yīng)用于該產(chǎn)品。1#TTI、2#TTI、3#TTI可以指示的產(chǎn)品活化能范圍分別為63～113kJ/mol、53～103kJ/mol、44～94kJ/mol。根據(jù)Labuza[17]在1982年提到的引起食品質(zhì)量下降的主要反應(yīng)的活化能，可以判斷出1#TTI可以應(yīng)用于因脂肪氧化、微生物增長而造成食品質(zhì)量損失的產(chǎn)品，如油脂、肉類、糕點、魚類等；2#TTI、3#TTI均可以應(yīng)用于因脂肪氧化而造成質(zhì)量損失的食品，如油脂、肉類等產(chǎn)品。

2.2 冷鮮肉氧化動力學(xué)參數(shù)的確定

冷鮮肉是低溫流通中主要因脂肪氧化而發(fā)生腐敗的典型。此外，冷鮮肉在0～4℃條件下通常可以保存3～7d，與所研制TTI的指示時間相近。因此，本實驗擬選用冷鮮肉進行研究，并選用與之在指示時間及活化能方面均匹配的時間-溫度指示器對其新鮮程度進行監(jiān)測。

一般來說，當(dāng)冷鮮肉的TBA值超過0.5mg/kg時，肉就會有氧化異味[18-19]。故以TBA值達到0.5mg/kg所經(jīng)歷的時間作為冷鮮肉的貨架壽命。

在本實驗中，通過測定冷鮮肉在因脂肪氧化而變質(zhì)過程中的TBA值點，可以繪制出冷鮮肉在貨架期內(nèi)TBA值隨時間變化的曲線，利用數(shù)據(jù)處理軟件對TBA值-時間曲線進行擬合，如圖3所示。據(jù)此得到冷鮮肉在不同溫度條件下的脂肪氧化速率。

圖3 3、12、25℃條件下冷鮮肉的TBA值與時間的關(guān)系Fig.3 Relationship between TBA in chilled pork and reaction time at 3, 12 ℃ and 25 ℃

由圖3可以看出，在各溫度條件下TBA值與時間呈顯著的指數(shù)關(guān)系，且隨著溫度的升高，TBA值達到終點值0.5mg/kg所需的時間依次變短：3℃條件下122h、12℃條件下85h、25℃條件下22h。說明隨著溫度的升高，冷鮮肉的脂肪氧化速率加快。

由圖3可以得到不同溫度條件下冷鮮肉的脂肪氧化速率及擬合曲線的相關(guān)系數(shù)，從而可以得到冷鮮肉的lnk與溫度對應(yīng)關(guān)系，如表3所示。

表3 冷鮮肉的lnk與溫度對應(yīng)值Table3 The lnk value of chilled pork under different temperatures

根據(jù)表3中不同溫度條件下所對應(yīng)的lnk值，可以作出lnk與1/T的關(guān)系曲線。該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R為－0.9694，故該模型可以達到顯著水平。即冷鮮肉的lnk與1/T之間遵循線性關(guān)系。因此可利用Arrhenius方程求出其活化能Ea和指前因子k0。

圖4 冷鮮肉的llnnk對11//T關(guān)系曲線Fig.4 The curve between lnk and 1/T for chilled pork

2.3 糖化酶型時間-溫度指示器監(jiān)測冷鮮肉的貯藏質(zhì)量

2.3.1 活化能匹配

對于冷鮮肉，測得其因脂肪氧化而變質(zhì)的活化能為65.72kJ/mol，則TTI的活化能只要在40.72～90.72kJ/mol之間，就能夠滿足活化能的匹配要求。

從表2可以看出，1#TTI、2#TTI、3#TTI的活化能均在該范圍之內(nèi)，故而均能滿足活化能的匹配要求。

2.3.2 恒溫條件下的反應(yīng)終點匹配

通過前面的實驗，已經(jīng)得到3種TTI在3、25℃恒溫條件下各自的指示時間，以及冷鮮肉在3、25℃恒溫條件下的貨架期，如表4所示。

表4 不同溫度條件下各TTI的指示時間及冷鮮肉的貨架期Table4 Indicating time of TTIs and shelf life of chilled pork under different temperatures

從表4可以看出，不論是在3℃還是25℃條件下，2#TTI的指示時間與冷鮮肉的貨架期均是最接近的，預(yù)測誤差分別為4.92%、9.09%(對食品質(zhì)量評估的誤差在15%以下，時間-溫度指示器就可以應(yīng)用于該食品中)。因此，可以認(rèn)為2#TTI的反應(yīng)終點與冷鮮肉的貨架壽命終點在恒溫條件下是相吻合的。

2.3.3 變溫條件下的反應(yīng)終點匹配

由于產(chǎn)品在流通的整個過程中很少會一直保持恒溫的條件，因此有必要在變溫條件下對2#TTI與冷鮮肉的匹配情況進行研究。

將制作好的2#TTI體系和獨立自封袋包裝的冷鮮肉樣品共同置于生化培養(yǎng)箱中，進行變溫實驗，如圖5所示，先在3℃條件下經(jīng)歷12h，再在23℃條件下經(jīng)歷3h，再在37℃條件下經(jīng)歷1h，然后在12℃條件下培養(yǎng)5h，最后在3℃條件下培養(yǎng)[20]。每隔一段時間，測定TTI體系的吸光度和冷鮮肉TBA值的變化情況。

圖5 變溫實驗中冷鮮肉經(jīng)歷的時間-溫度歷程Fig.5 The time-temperature course of chilled pork under variable temperatures

圖6 變溫條件下冷鮮肉的TBA值隨時間的變化Fig.6 The change in TBA value of chilled pork over time under variable temperatures

由圖6可以看出，在整個變溫實驗中，TBA值逐漸變大，說明隨著時間的延長，冷鮮肉的脂肪氧化速率加大，冷鮮肉的TBA值由初始的0.24mg/kg逐漸變大，最終達到0.5mg/kg的時間為49h左右；從圖中還可以看到，3℃條件下冷鮮肉的TBA值變化比較緩慢，37℃條件下TBA值變化最快，12、23℃條件下TBA值變化次之，說明各溫度條件下的變化速率不同，溫度越高脂肪氧化速率越大。

圖7 變溫條件下2#TTI的吸光度隨時間的變化Fig.7 The change in absorbance of 2# TTI over time under variable temperatures

與之對應(yīng)的2#TTI體系吸光度變化情況如圖7所示?？梢钥吹剑?#TTI體系在52h左右時，吸光度接近于0，說明此時TTI體系的顏色已變?yōu)闊o色，反應(yīng)達到終點。2#TTI體系在3℃條件下吸光度降低比較緩慢，37℃條件下吸光度曲線很陡峭，說明其變化很快，12、23℃條件下次之，這與冷鮮肉脂肪氧化速率受溫度的影響情況是一致的。

式中：F(X)t為TTI的響應(yīng)函數(shù)；kT0TI為TTI的指前因子；為TTI的活化能/(J/mol)；為TTI經(jīng)歷的有效溫度/K。

式中：Q(A)t為食品的質(zhì)量函數(shù)；kf0ood為食品的指前因子；食品的活化能/(J/mol)；為食品經(jīng)歷的有效溫度/K。

對于圖5所示的變溫歷程，2#TTI在達到指示終點時：

式中：k3、k12、k23、k37分別為3、12、23、37℃條件下2#TTI的吸光度變化速率，積分上下限為圖5所示變溫歷程中各段所對應(yīng)的起止時間。

根據(jù)公式(3)及2#TTI的指前因子、活化能值，可以得到2#TTI的反應(yīng)速率表達式

由此，可以得到2#TTI在各溫度條件下的反應(yīng)速率，如表5所示。

表5 2#TTI在不同溫度條件下的反應(yīng)速率Table5 The reaction rates of 2# TTI under different temperatures

將表5中的反應(yīng)速率帶入式(8)可以得到達到指示終點時的F(X)t=2.236。將該值及2#TTI的指前因子=1.48×1013h-1、活化能78.95kJ/mol、指示時間t=52h帶入到公式(6)中，可以得到該變溫歷程中2#TTI的等效溫度=284K。

對于圖5所示的變溫歷程，冷鮮肉在達到貨架終點時：

式中：k3、k12、k23、k37分別為3、12、23、37℃條件下冷鮮肉的脂肪氧化速率。

根據(jù)公式(3)～(5)，冷鮮肉的脂肪氧化速率函數(shù)可以表示為：

由此，可以得到各溫度條件下的反應(yīng)速率，如表6所示。

表6 冷鮮肉在不同溫度條件下的脂肪氧化速率Table6 The fat oxidation rates of chilled pork under different temperattuurreess

將表6中的反應(yīng)速率帶入(10)式可以得到冷鮮肉達到貨架終點時的Q(A)t=1.739。將該值及冷鮮肉的指前因子=4.97×1010h-1、活化能65.72kJ/mol、貨架壽命t=49h帶入到公式(7)中，可以得到該變溫歷程中冷鮮肉的等效溫度=285K。

由上述計算可知，在圖5所示的變溫歷程下，2#TTI監(jiān)測冷鮮肉的Teff誤差為1℃，貨架壽命預(yù)測誤差為8.16%＜15%，在誤差要求的范圍之內(nèi)。因此，在變溫情況下，2#TTI的反應(yīng)終點與冷鮮肉的貨架壽命終點亦是相吻合的。

綜上所述，2#TTI的活化能與冷鮮肉的活化能差值小于25kJ/mol，其對冷鮮肉質(zhì)量評估的誤差在恒溫與變溫條件下均低于15%，因此2#TTI可以用來監(jiān)測冷鮮肉在流通過程中的質(zhì)量狀況。實際應(yīng)用中，若TTI的顏色顯示為深紫色，則說明食品一直處于低溫的環(huán)境下，新鮮度良好；若TTI的顏色呈淺粉色，則表明食品已經(jīng)處于變質(zhì)的邊緣，營養(yǎng)流失比較嚴(yán)重。

3 結(jié) 論

本實驗確定了加酶量分別為30、50、75?L的3種糖化酶型時間-溫度指示器的活化能分別為88.59、78.95、69.76kJ/mol。根據(jù)TTI活化能必須與食品活化能相匹配的原則，得到了它們各自可以指示的食品類型：加酶量為30?L的TTI可以應(yīng)用于因脂肪氧化、微生物增長而造成食品質(zhì)量損失的產(chǎn)品；加酶量為50、75?L的TTI可以應(yīng)用于因脂肪氧化而造成質(zhì)量損失的食品。冷鮮肉是低溫流通中主要因脂肪氧化而發(fā)生腐敗的典型。研究工作通過測定冷鮮肉TBA值隨時間的變化曲線，對冷鮮肉的變質(zhì)機理及其動力學(xué)性能進行了研究，得到不同溫度條件下脂肪氧化的速率，計算出冷鮮肉的活化能，并根據(jù)TBA值達到0.5mg/kg時即認(rèn)定變質(zhì)來計算冷鮮肉的貨架壽命。在恒溫、變溫條件下，對冷鮮肉和TTI進行實驗，驗證TTI反應(yīng)終點與食品貨架壽命終點的匹配性，結(jié)果表明：加酶量為50?L的糖化酶型時間-溫度指示器可以較準(zhǔn)確地用于預(yù)測冷鮮肉的貨架壽命。

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Glucoamylase Time-Temperature Indicators based on Fat Oxidation of Chilled Pork

QIAN Jing，ZHENG Guang-lin，F(xiàn)ENG Qin
(School of Mechanical Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The dynamic properties and activation energies of three glucoamylase types of TTIs (time-temperature indicators) were investigated. The fat oxidation in chilled pork was investigated to acquire its activation energy and shelf life. According to the activation energy and end-point matching principle between TTI and foods, matching experiments were set up under both constant and variable temperatures. One (50 μL enzyme dosage) of the glucoamylase TTIs was selected to predict the shelf life of chilled pork accurately based on experiments and following calculation.

time-temperature indicator (TTI)；glucoamylase；activation energy；chilled pork；fat oxidation

TS251.1

B

1002-6630(2013)18-0343-06

10.7506/spkx1002-6630-201318070

2013-03-30

教育部第44批回國留學(xué)人員科研啟動基金項目

錢靜(1968—)，女，副教授，博士，研究方向為運輸包裝。E-mail：qj639@jiangnan.edu.cn