劉曉雪 程智慧

（西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100）

大蒜（Allium sativumL.）為百合科（Liliaceae）蔥屬二年生草本植物，營養(yǎng)繁 殖，一般無有性世代，或不能開花結籽。因此，用鱗芽作種質資源保存，需要年年到田間繁殖更新，既占用大量土地資源，耗費人力物力，又不利于種質穩(wěn)定性的保持。而且，在自然條件下，植株及鱗莖有可能遭受病蟲害的侵襲而喪失種質的特性，不 便于種質的管理、交換與發(fā)放。

超低溫保存是指在-80℃以下的超低溫環(huán)境中保存種質資源，是20世紀70年代發(fā)展起來的一套現(xiàn)代生物學保存技術（Nag & Street，1973）。常以液氮（-196℃）為冷源，因此超低溫保存又稱液氮保存。近年來，超低溫保存作為一種植物種質離體保存新技術，以其設備要求簡單，處理步驟相對簡便，效果和重演性好等優(yōu)點，成為種質保存研究的熱點（Sakai & Engelmann，2007）。

大蒜在每年的營養(yǎng)繁殖過程中，容易感染病毒并積累在鱗莖中隨 世代傳遞，引發(fā)病毒?。ˋyabe & Sumi，2001）。病毒病易導致大蒜種性退化，鱗莖商品品質降低，甚至很多從國外引進的新優(yōu)品種，也因病毒侵染種性退化，品質降低而再不能用于大蒜商品生產，造成巨大經濟損失，嚴重制約了 大蒜產業(yè)的發(fā)展。

傳統(tǒng)大蒜脫毒方法包括莖尖培養(yǎng)、熱處理結合莖尖培養(yǎng)、莖尖二次培養(yǎng)、莖尖微體嫁接、愈傷組織培養(yǎng)等方法。莖尖培養(yǎng)實際操作難度大；通過愈傷組織途徑分化出芽長成植株也可獲得無毒苗，但是再生植株遺傳變異率較高。與傳統(tǒng)脫毒方法相比，超低溫法具有植株脫毒率高，操作簡便，再生植株遺傳穩(wěn)定性好，增殖率高且能與超低溫保存種質結合利用等明顯優(yōu)勢 （Wang et al.，2006；Feng et al.，2010）。

1 植物超低溫保存及脫毒原理

1.1 超低溫保存原理

在超低溫條件下，幾乎所有的細胞代謝活動和生長過程都停止，但細胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能卻可保存，因而細胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性得以保證（Kartha & Engelmann，1994）。超低溫保存原理一般基于以下兩大理論：

① 細胞冰凍與傷害理論。生物細胞在降溫過程中只要降溫速率低于脫水的連續(xù)性，細胞內水分就會不斷向胞外擴散，原生質體濃縮，從而降低細胞內含物冰點。這種逐漸除去細胞內水分的過程稱為保護性脫水（Protective dehydration）。但是過度脫水會使細胞內有毒物質積累，破壞蛋白質和酶的結構，膜的完整性受到傷害。除此之外，如果胞內結冰，還會造成機械傷害（Ice injury）。超低溫保存就是以避免產生這兩種傷害為目的 （王培忠 等，2007）。

② 溶液的玻璃化理論。玻璃化（Vitrification）是指一個生物物理學過程——細胞和溶液在快速降溫時進入一種均一的無定形狀態(tài)，細胞內的水不形成冰而進入過冷液體狀態(tài)，是一種對細胞損傷最小的狀態(tài)（Rall & Fahy，1985）。Luyet（1937）認為，液體有兩種固 化方式，一是不連續(xù)地固化成晶體；二是連續(xù)固化成非晶體，進入玻璃化狀態(tài)。這時液體實際上還是液態(tài)存在形式，且不會對組織和細胞造成機械傷害。植物種質超低溫保存成功的關鍵是要避免細胞、組織內結冰，使之發(fā)生玻璃化，以安全地貯存。

任何液體只要有足夠的降溫速度都可進入玻璃態(tài)。例如要使純水玻璃化，降溫速度需高達1010℃·s-1，這用常規(guī)的冷卻速度是難以達到的。通過添加高濃度的冰凍保護劑可以顯著降低液體進入玻璃態(tài)所需的降溫速度（李廣武，1998），促進保存材料組織在結冰早期進行保護性脫水，阻止冰晶生長，從而使之較易達到玻璃化狀態(tài)。

1.2 超低溫脫毒原理

利用超低溫方法脫毒的材料多為植物莖尖。Feng 等（2010）認為供試莖尖經超低溫凍存后，其最頂端以及第1、2 葉原基由于細胞核與細胞質體積比例大，內含物質濃度高，細胞內空泡少且維管組織發(fā)育不全，因此能夠經受住低溫而存活下來。而這部分組織病原物含量較少甚至不含病原物。與此同時莖尖下部其余部分因細胞較成熟，水分含量多而易被凍死，這部分組織多含有大量病原物。最終，經過超低溫處理，含有病原物的組織凍傷壞死，而不含病原物的組織存活下來，繼續(xù)分裂分化形成脫毒植株。

2 大蒜種質超低溫保存研究現(xiàn)狀

超低溫作為種質保存和脫毒的一種新方法，已經應用于多種植物上，包括馬鈴薯（Wang et al.，2006）、甘薯（Pennycooke & Towill，2000；Feng et al.，2010）、百合（Chen et al.，2011）、菊花（Hitmi et al.，1997；Halmagyi et al.，2004）、蘋果（Paul et al.，2000）等。大蒜超低溫研究多集中在超低溫保存體系的建立上。

超低溫保存按其降溫冰凍方式不同，有多種不同方法，包括早期的慢速冰凍法、快速冰凍法、分步降溫法、干燥冰凍法等，以及目前多采用的玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法（馬千全 等，2007；吳昀 等，2012）。已有的研究采用的大蒜材料主要是鱗芽莖尖，也有報道用氣生鱗莖和未成熟花序作為外植體材料。所采用的超低溫方法以基于玻璃化的玻璃化法和小滴玻璃化法為主，尚未見其他超低溫方法用于大蒜種質保存的報道。

2.1 超低溫保存材料的選擇

由于超低溫保存對材料降溫速率的特殊要求，因此所選材料需具有體積小、再生能力強且分化程度低的特征，一般選擇莖尖分生組織作為超低溫保存材料。

對大蒜的超低溫保存而言，傳統(tǒng)且常見的保存材料為大蒜鱗芽莖尖（Makowska et al.，1999；Baek et al.，2003；Kim et al.，2004，2006，2007；王 艷 軍 等，2005；徐 培 文 等，2005）。Baek 等（2003）對大蒜莖尖進行了超低溫保存，結果發(fā)現(xiàn)外植體來源與大小對凍后材料的存活率及再生率都有很大影響。在最適條件下，莖尖再生率可達90%以上。另有報道采用玻璃化法凍存大蒜胚性愈傷組織，最高存活率為30%（Sudarmonowati，2001）。但因這種材料凍后存活率低且遺傳穩(wěn)定性較差，一直未得到普遍采用。

近年來，國外學者開始嘗試采用大蒜其他材料進行超低溫保存。Kim 等（2007）比較了大蒜鱗莖莖尖、未成熟花序、成熟的氣生鱗莖及獨頭蒜莖尖等材料的超低溫保存效果，認為未成熟花序具有污染率低、凍后幼苗成苗快等優(yōu)點。Makowska 等（1999）比較研究了鱗芽莖尖和氣生鱗莖兩種材料的超低溫保存效果，表明鱗芽莖尖存活率和再生率均高于氣生鱗莖，但氣生鱗莖凍后一致性好且污染率低。Keller 等（2010）又以大蒜未成熟花序基部為材料進行超低溫保存，認為未成熟花序基部具有直接取材、無需離體擴繁、污染率低等優(yōu)點。

雖然目前鱗芽莖尖仍被研究者廣泛用于大蒜超低溫保存，但其莖尖剝取有一定難度，費時費力，因此不便于大蒜超低溫技術的推廣應用。采用氣生鱗莖作材料，盡管一致性好，污染率低，但凍后存活率和再生率較低是其最大缺陷。而未成熟花序基部作為超低溫保存材料，不僅具有操作容易、污染率低等優(yōu)點，同時具有較高存活率和再生率，是大蒜超低溫保存極具應用潛力的新型材料。

2.2 超低溫保存方法的選擇

目前植物超低溫保存方法以玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法為主。在大蒜超低溫保存中，玻璃化法研究最多（Makowska et al.，1999；Baek et al.，2003；Kim et al.，2004，2007；Volk et al.，2004；王艷軍 等，2005；Ellis et al.，2006；Keller et al.，2010），但Keller等（2010）研究證明小滴玻璃化法保存大蒜莖尖，其存活率、再生率均高于玻璃化法。Kim 等（2006）利用小滴玻璃化法保存大蒜莖尖，再生率可達77.4%～95.4%。

相較于傳統(tǒng)的玻璃化法，小滴玻璃化法適用于對脫水及冷刺激較不敏感的植物材料，且具有降溫速率快、凍后成活率高等優(yōu)點，是適于大蒜種質超低溫保存的一種方法。

2.3 玻璃化溶液的選擇

在植物超低溫保存研究中，常用的玻璃化 溶液，即PVS（Plant Vitrification Solution）主要有3種：PVS2〔30% 甘油+15% 乙二醇+15% 二甲亞砜（DMSO）+0.4 mol·L-1蔗糖+MS 液體培養(yǎng)基〕、PVS3（50% 甘油+50% 蔗糖+MS 液體培養(yǎng)基）和PVS4（35% 甘油+20% 乙二醇+0.6 mol·L-1蔗糖+MS 液體培養(yǎng)基）（Sakai & Engelmann，2007）。其中，PVS2 和PVS3 在大蒜中應用最普遍。

Kim 等（2004）研究表明，PVS3 是保存大蒜最有效的玻璃化溶液，用PVS3處理150～180 min，大蒜再生率可達92%。Makowska 等（1999）研究證明使用PVS3 溶液保存大蒜效果優(yōu)于PVS2。Keller 等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，PVS3 確實對大蒜超低溫保存具有良好效果，PVS4 則沒有效果，不能用于大蒜超低溫保存。Ellis 等（2006）研究發(fā)現(xiàn)PVS2 和PVS3 保存大蒜種質效果無明顯差異。

PVS3 與PVS2 相比，不含二甲亞砜和乙二醇兩種成分，雖然脫水效果不如PVS2，但對材料的毒害作用較小。因此，在大蒜超低溫保存中，較為理想的玻璃化溶液是PVS3。

2.4 影響超低溫保存效果的因素

超低溫保存植物研究中，植物凍后存活率和再生率不僅與超低溫體系各個步驟的優(yōu)化有關，還會受植物基因型的影響。同種植物不同基因型和品種，其超低溫保存效果往往差異很大。

Volk 等（2004）利用AFLP 標記區(qū)別出不同基因型的美國大蒜資源用于超低溫保存試驗，以研究大蒜不同基因型對超低溫凍存的反應。結果雖然不同基因型之間存活率和再生率差異顯著，但將超低溫應用于不同基因型的大蒜資源保存是可行的。

王艷軍等（2005）用山東蒼山大蒜進行了超低溫保存研究，存活率最高達到100%。Kim 等（2004）超低溫保存了10個大蒜品種，再生率為72%～95%。Kim 等（2007）超低溫保存韓國大蒜品種超過930個，平均存活率79.9%，再生率78.2%。在大蒜超低溫保存體系研究中，目前還沒有一個廣泛適用于大蒜 各種基因型的完整體系。

除材料基因型對超低溫保存效果有很大影響以外，其田間生長過程中的生理狀態(tài)以及采收后保存等條件也是重要影響因素。

英國Lynch 等（2010）認為大蒜超低溫保存的重點在于確定各大蒜品種在生長季節(jié)和超低溫保存后再生長的生理變化。因為收獲后貯存體系和貯存時間影響組織培養(yǎng)條件下大蒜材料的反應。Kim 等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，采后貯藏3個月或6個月后再進行超低溫保存的大蒜再生率最高。

總之，影響大蒜超低溫保存效果的因素紛繁復雜，還需要進行大量的研究工作才能闡明其中的規(guī)律，探索出一條能夠廣泛用于大蒜超低溫保存的完整體系。

3 大蒜脫毒研究

我國及世界大蒜主產區(qū)的主栽大蒜品種和品系往往受多種病毒復合侵染，洋蔥黃矮病毒（OYDV）、韭蔥黃條斑病毒（LYSV）和洋蔥螨傳潛隱病毒（OMBFV）是主要病毒種類。青蔥潛隱病毒（SLV）、大蒜普通潛隱病毒（GCLV）和馬鈴薯Y 病毒組的侵染率較低，其發(fā)病程度與地區(qū)緯度有關，可能受栽培地區(qū)的氣溫、光照條件及毒源的影響（徐培文 等，1999）。

早在1973年Havránek（1973）通過培養(yǎng)0.4～0.5 mm 莖尖獲得脫除大蒜花葉病毒（GMV）的植株以來，世界各國研究者進行了很多大蒜脫毒方面的研究。目前常用技術主要有：莖尖培養(yǎng)、溫熱處理、花序軸離體培養(yǎng)、莖盤培養(yǎng)及莖盤圓頂結構培養(yǎng)等（趙心愛和薛慶中，2002）。

3.1 脫毒材料

大蒜脫毒傳統(tǒng)材料為莖尖分生組織，Sant 等（1982）用0.4～0.9 mm 莖尖培養(yǎng)獲得了脫毒大蒜植株。Walkey 等（1987）以莖尖分生組織為材料培養(yǎng)獲得大蒜，脫毒率為25%～50%。Martin 等（1995）用ELISA 檢測出4種大蒜病毒，并以莖尖為材料培養(yǎng)獲得對不同病毒的脫毒效果：大蒜普通潛隱病毒脫毒率62%，韭蔥黃條斑病毒脫毒率100%，洋蔥黃矮病毒脫毒率92%，洋蔥螨傳潛隱病毒脫毒率54%以下。研究還發(fā)現(xiàn)，用于脫毒的莖尖分生組織越小，脫毒效果越好，但材料＜0.4 mm時無法再生。Bertaccini 等（2004）以莖尖分生組織為材料進行脫毒培養(yǎng)，RT-PCR檢測結果表明對大蒜螨傳病毒的脫毒率為27%。

由于以莖尖分生組織為材料進行脫毒培養(yǎng)對材料大小要求嚴格，莖尖較小操作起來較為困難且脫毒率較低。因此有研究者開始采用大蒜其他部位的材料進行脫毒研究。

Wang 等（1994）以大蒜花莖頂端為材料進行脫毒培養(yǎng)，脫毒率為77.6%，高于含3個葉原基的莖尖培養(yǎng)（26.5%）和含1～2個葉原基的莖尖培養(yǎng)（45.4%）。Ayabe 和Sumi（2001）以大蒜莖盤為材料進行脫毒培養(yǎng)，RT-PCR 和免疫組織印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中病毒被脫除；電鏡觀察不同發(fā)育階段組織表明，脫毒可能與維管束結構階段發(fā)育有關。Haque 等（2007）以2～3 mm 大蒜根尖分生組織為材料進行脫毒研究，經RT-PCR檢測：根尖分生組織培養(yǎng)能夠有效脫除大蒜主要病毒，是可用于大蒜脫毒的一種高效新型材料。

3.2 脫毒方法

目前大蒜脫毒常用的方法主要是基于植物組織培養(yǎng)技術的莖尖培養(yǎng)，也有莖尖培養(yǎng)結合熱處理進行脫毒的報道，化學處理脫毒效果較差。

Walkey 等（1987）研究發(fā)現(xiàn)，若在組織培養(yǎng)前將材料進行38℃處理，可使脫毒率從25%提高到85%。Ramírez-Malagón 等（2006）比較了溫熱處理、化學處理和分生組織培養(yǎng)對Taiwan和Chileno 兩個大蒜品種的脫毒效果，脫毒率溫熱處理分別為63% 和70.9%，化學處理分別為27%和34.8%，分生組織培養(yǎng)均為64%。

3.3 脫毒苗的應用

大蒜脫毒研究主要集中于脫毒材料及方法的選擇，脫毒試管苗繁育及田間表現(xiàn)的研究報道較少。Xu 等（1994）優(yōu)化了大蒜莖尖培養(yǎng)脫毒試管苗及移栽田間后的管理，并使用氣生鱗莖進行無毒苗擴繁，提高了大蒜脫毒苗的增殖系數(shù)，為脫毒苗的生產應用提供了依據。

3.4 超低溫處理與大蒜脫毒

與傳統(tǒng)脫毒方法相比，超低溫處理具有植株脫毒率高、操作簡便、再生植株遺傳穩(wěn)定性好且增殖率高等明顯優(yōu)勢，同時能與超低溫保存種質相結合，既保存了種質又能獲得無毒種苗（Wang et al.，2006）。目前，超低溫脫毒技術在很多植物上都有應用，包 括黃瓜（Helliot et al.，2002）、葡萄（Wang et al.，2003）、馬鈴薯（Wang et al.，2006）、甘薯（Feng et al.，2010）、香蕉及一些果樹砧木（Brison et al.，1997）等的脫毒。Wang 等（2006）研究表明：馬鈴薯經超低溫脫毒后，馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）和馬鈴薯Y 病毒（PVY）的脫毒率分別可達83%～86%和91%～95%，高于分生組織培養(yǎng)（56% 和62%）和溫熱處理脫毒（50% 和 65%），與溫熱處理結合分生組織脫毒率相近（90%和93%）。證明超低溫處理作為脫毒的新方法，不僅脫毒效率高且操作簡便。

目前國內外對大蒜脫毒方法及其效果的研究多采用莖尖分生組織培養(yǎng)、溫熱處理、莖盤培養(yǎng)和花莖頂端培養(yǎng)等傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方法。應用超低溫處理進行大蒜脫毒研究的相關報道很少，目前僅有韓國Kim 等（2007）用RT-PCR檢測表明，一些被病毒感染的大蒜材料經超低溫保存后再生的幼苗病毒量減少，而系統(tǒng)的研究尚未見報道。

4 存在問題與展望

超低溫技術作為一項大蒜種質資源保存及脫毒的新技術，盡管有著顯而易見的優(yōu)勢，但由于其研究起步較晚，加之很多內在機理尚未揭示，至今仍有很多亟待解決的問題。

4.1 取材方面

在現(xiàn)有的大蒜超低溫研究中主要材料為大蒜莖尖。而這種材料存在一定問題。首先是材料不足，大蒜莖尖可供切取的數(shù)目有限，往往不能滿足超低溫保存的要求，而且從鱗芽中剝取莖尖操作難度也較大；其次是材料來源，鱗芽來源于土壤，土壤環(huán)境比較復雜，導致所取材料極有可能沾染一些病原物，如細菌、真菌、病毒和昆蟲類。這給隨后的組織培養(yǎng)帶來了一定困難：如果消毒不徹底，帶菌材料的存活率會受到影響，從而影響超低溫保存的效率；消毒過度又會引起材料的損傷，同樣也對材料存活率有不利影響。

已有研究開始嘗試將大蒜氣生鱗莖、未成熟花序等材料用于超低溫保存。此外，還可通過莖盤或花序軸誘導生成大蒜不定芽或側芽，既解決了材料少的問題，又降低了莖尖剝取的難度，提高了效率。同時由于不定芽體系在離體無菌條件下建立，因此可排除病原物的干擾，降低試材污染率。隨后的研究可以在取材方面進行進一步的探索，如蒜薹頂端分生組織——花序軸也可用于超低溫保存，以及如何提高大蒜不定芽的增殖系數(shù)等。

4.2 遺傳穩(wěn)定性檢測方面

現(xiàn)有研究中對大蒜超低溫凍存后材料的遺傳穩(wěn)定性檢測雖有涉及，但研究都不系統(tǒng)。而且普遍采用的檢測方法多側重于分子、染色體等微觀層面。因此對試材再生后田間種植的植株表現(xiàn)及生態(tài) 適應性等宏觀表型因素需要進一步分析，以明確超低溫凍存對大蒜生理生態(tài)方面產生的效應。

4.3 超低溫脫毒方面

目前大蒜超低溫研究多集中于對超低溫保存程序的建立和優(yōu)化。大蒜病毒病是生產上急需解決的問題之一。因此，需進行超低溫脫除大蒜主要病毒的研究，為繁育大蒜脫毒苗，保持優(yōu)良品種種性，解決實際生產問題開辟新的途徑。

4.4 超低溫保存體系優(yōu)化方面

大蒜超低溫保存程序根據其品種的不同，同一品種取材部位的不同，乃至所選用的超低溫凍存方法的不同而存在很大差異，且經凍存后大蒜的存活率和再生率結果差異也較大。目前尚未建立起具有廣泛適用性的大蒜超低溫保存體系。

因此，在今后的研究中，應著力研發(fā)廣泛適用于不同大蒜品種，且具有穩(wěn)定存活率和再生率的超低溫保存體系，為該項技術投入生產實踐奠定基礎。

此外，大蒜超低溫保存過程中的組織細胞超微結構變化尚未見報道。超低溫凍存過程涉及一系列細胞凍融的物理化學變化，這些變化勢必會引起細胞結構方面的變化。

研究這些細胞水平的結構變化對于深入了解超低溫保存技術的實質，揭示其內在規(guī)律，從而有目的地優(yōu)化大蒜超低溫保存體系有重要意義。在以后的研究中，可通過掃描電鏡、透射電鏡、光譜分析法、差熱分析法及核磁共振等方法進行此類問題的探索。

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