李學(xué)琴，程建文，魏玲，徐家寧，范勇

（1.昌吉學(xué)院化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)系，新疆昌吉831100；2.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012）

紅花屬菊科，現(xiàn)今主要栽種于新疆、甘肅、河南、浙江、四川等地，其中新疆是我國(guó)種植歷史最悠久，種植面積最大的紅花產(chǎn)地之一，品種資源占到全國(guó)的50%以上。紅花中主要含有紅色素和黃色素，其中紅色素含量約占0.1%～0.2%，黃色素含量為30%左右[1]。

紅花色素在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。目前對(duì)紅花色素分析的主要方法有，分光光度法[2-3]、高效液相色譜法[4-5]、熒光分析法[6]。其中熒光分析法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等特點(diǎn)。本文采用熒光分析法分別對(duì)紅花紅色素和紅花黃色素分別進(jìn)行研究，研究pH、溫度、溶劑、金屬離子對(duì)紅花紅色素和紅花黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊?，為以后的探索研究提供參考?/p>

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RF-5301 熒光分光光度計(jì)：日本島津；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：上海嘉鵬科技有限公司；KQ-100型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；XYJ-802離心成淀機(jī)：江蘇醫(yī)療儀器廠；HR-200 電子天平：A&D Company，Limited；微量取液器：北京青云航天儀表有限公司。

紅花：新疆產(chǎn)，粉碎（過(guò)120 目篩）；丙酮：分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：分析純，西安化學(xué)試劑廠；硫酸：分析純，烏魯木齊市天岳化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵：分析純，上海第二鋼鐵廠；氯化鋁：分析純，北京市朝陽(yáng)區(qū)化肥廠；硝酸鉛：分析純，北京紅星化工廠；硫酸銨：分析純，成都化學(xué)試劑廠。

1.2 方法與步驟

1.2.1 紅花紅、黃色素的處理

取2 g 紅花粉末，經(jīng)蒸餾水多次浸泡，超聲振蕩過(guò)濾，收集濾渣，合并濾液，該濾液作為黃色素待測(cè)液。濾渣晾干后用50%丙酮溶液浸泡，重復(fù)提取3 次，濾渣呈土黃色，合并濾液，該濾液作為紅花紅色素待測(cè)液。

1.2.2 紅色素?zé)晒夥治鰲l件的選擇

取10 mL 比色管，加入紅色素樣品濾液3 mL，用50%丙酮溶液定容、搖勻。在220 nm～780 nm 間掃描得知樣品溶液的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)（λex=365 nm，λem=735 nm）。

1.2.2.1 紅花紅色素在50%丙酮溶劑中的熒光性能

50%丙酮溶劑，在激發(fā)波長(zhǎng)λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下，測(cè)定50%丙酮溶劑熒光性能。用同樣的方法，取3 mL 的50%丙酮提取液，測(cè)提取液的熒光性能。

1.2.2.2 熒光分析中紅色素用量的選取

取9 種不同濃度的溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下，測(cè)定不同濃度紅花紅色素的熒光性能。

1.2.2.3 溫度對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/p>

取4 只10 mL 比色管，各加入5.2.1 的紅色素濾液3 mL，然后各加入50%丙酮溶液7 mL，攪勻。將試管放入水浴鍋中，溫度控制在25、35、50、65 ℃條件下水浴2 min，然后冷卻至室溫。分別取上述4 種不同溫度的溶液各3L，置熒光分析皿中，在λex=365nm，在700nm～750 nm 的掃描范圍條件下測(cè)定不同溫度環(huán)境下紅花紅色素的熒光性能。

1.2.2.4 pH 對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/p>

取10 只比色管，各加入50%丙酮溶液7 mL，用0.2 moL/L 氫氧化鈉和0.1 moL/L 硫酸溶液分別調(diào)節(jié)酸堿度使10 只比色管中的pH 從1～10 排列，再分別加入5.2.1 的紅色素濾液3 mL，搖勻。取上述10 種不同pH 的溶液各3 mL，置熒光分析皿中，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下測(cè)定不同pH 環(huán)境下紅花紅色素的熒光性能。

1.2.2.5 金屬離子對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/p>

取4 只10 mL 比色管，分別加入1.2.1 的紅色素濾液3 mL，然后將等量的0.01 moL/L 金屬化合物（FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2）及硫酸銨溶液加入相應(yīng)的比色管中，用50%丙酮溶液定容，搖勻。分別取上述4 種含不同鹽的溶液3 mL，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下測(cè)定紅花紅色素的熒光性能。

1.2.3 黃色素?zé)晒夥治鰲l件的選擇

黃色素水溶液，在220 nm～780n m 之間掃描，得知樣品溶液的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)λex= 242 nm，λem=485 nm。

1.2.3.1 紅花黃色素在水作溶劑中的熒光性能

取3 mL 的蒸餾水，在激發(fā)波長(zhǎng)λex= 242 nm，在460 nm～550 nm 的掃描范圍條件下，測(cè)定蒸餾水熒光性能。用同樣的方法，取3 mL 的水提取液，測(cè)提取液的熒光性能。

1.2.3.2 熒光分析中黃色素用量的選取

在室溫條件下，分別系列濃度的黃色素提取液，用熒光分光光度計(jì)掃描，激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，掃描范圍在460 nm～550 nm 得到黃色素用量—熒光強(qiáng)度曲線。

1.2.3.3 溫度對(duì)紅花黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/p>

黃色素水提取液，控制在25、35、50、65、80、90 ℃等溫度下水浴2 min，冷卻至室溫。在激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，掃描范圍：460 nm～550 nm 條件下測(cè)定不同溫度環(huán)境下紅花黃色素的熒光性能。

1.2.3.4 pH 對(duì)紅花黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/p>

黃色素樣品濾液40 μL，用0.2 moL/L 氫氧化鈉和0.1 moL/L 硫酸溶液分別調(diào)節(jié)蒸餾水酸堿度pH 從1～10，室溫下在激發(fā)波長(zhǎng)λex= 242 nm，掃描范圍：460 nm～550 nm 條件下測(cè)定不同pH 環(huán)境下紅花黃色素的熒光性能。

1.2.3.5 金屬離子對(duì)紅花黃色素?zé)晒庑阅苡绊?/p>

取3 只10 mL 比色管，分別加入黃色素樣品濾液120 μL，將等量0.01 moL/L 金屬化合物[FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2]加到相應(yīng)的比色管中，用蒸餾水定容，搖勻。分別取上述3 種含不同金屬離子的溶液3mL，室溫下在激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，掃描范圍：460 nm～550 nm 條件下測(cè)定黃色素的熒光性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅花紅色素50%丙酮溶液熒光性能

取3 mL 的50%丙酮溶劑，在激發(fā)波長(zhǎng)λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下，測(cè)定50%丙酮溶劑的熒光性能。用同樣的方法，取3 mL 的50%丙酮提取液，置于熒光分析皿中，測(cè)定提取液的熒光性能見，圖1。

圖1 50%丙酮溶劑中紅花紅色素?zé)晒庑阅蹻ig.1 Fluorescentspectral properties of the carthamine in 50%acetone

由圖1 可知，50%丙酮溶劑在700 nm～750 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)波峰，表明在735 nm 處的波峰是由紅色素產(chǎn)生的，50%丙酮溶劑對(duì)紅花紅色素的熒光性能沒(méi)有影響。

2.2 熒光分析中紅色素用量的選取

取9 只試管，各加入1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL 50%的丙酮溶液，再各加入1.2.1 的紅色素提取液3 mL，搖勻。取9 種不同濃度的溶液3 mL，在激發(fā)波長(zhǎng)λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下，測(cè)定不同濃度紅花紅色素的熒光性能，見圖2。

圖2 紅色素用量對(duì)紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊慒ig.2 Effect of carthamine content to fluorescent spectral properties

從圖2 可知，分別用1 mL 到7 mL 的50%丙酮溶液稀釋3 mL 紅色素提取液，紅色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，用7 mL 的50%丙酮溶液稀釋時(shí)，紅色素的熒光強(qiáng)度最達(dá)到最強(qiáng)。而用8、9 mL 的50%丙酮溶液稀釋時(shí)，紅色素的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。推測(cè)其原因：紅色素濃度較大時(shí)，激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象。

2.3 溫度對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/h3>

取4 只10 mL 比色管，各加入1.2.1 的濾液3 mL，用50%丙酮溶液定容攪勻。將比色管放入水浴鍋中，溫度控制在25、35、50、65 ℃條件下水浴2 min，然后冷卻至室溫。分別取上述4 種不同溫度的溶液各3 mL，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下測(cè)定不同溫度環(huán)境下紅花紅色素的熒光性能，見圖3。

圖3 溫度對(duì)紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊慒ig.3 Effect of temperature to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

從圖3 可以看出，隨著溫度的升高紅色素的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，其中65 ℃時(shí)紅色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度最弱，25 ℃時(shí)紅色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。推測(cè)其可能的原因是，溫度升高時(shí)，介質(zhì)黏度減小，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞幾率增加，從而使分子無(wú)輻射躍遷增加，熒光效率降低。

2.4 pH 對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/h3>

取10 只比色管，各加入50%丙酮溶液7 mL，用0.2 moL/L 氫氧化鈉和0.1 moL/L 硫酸溶液分別調(diào)節(jié)酸堿度使10 只比色管中的pH 從1～10 排列，再分別加入1.2.1 的紅色素濾液3 mL，搖勻。取上述10 種不同pH 的溶液各3 mL，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm的掃描范圍條件下測(cè)定不同pH 環(huán)境下紅花紅色素的熒光性能，見圖4。

圖4 pH 對(duì)紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊慒ig.4 Effect of pH to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

由圖4 得知，紅花紅色素溶液pH 從1 到10 的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，且pH=1 時(shí)，紅花紅色素的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。推測(cè)其原因：由于分子內(nèi)存在氫鍵作用，使分子結(jié)構(gòu)呈多環(huán)狀。pH=1 時(shí)，質(zhì)子化作用比較強(qiáng)，使得氫鍵的鍵能增強(qiáng)，致使整個(gè)分子結(jié)構(gòu)的剛性增強(qiáng)，所以在pH=1 時(shí)紅色素的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。

2.5 金屬離子對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅苡绊?/h3>

取4 只10 mL 比色管，分別加入1.2.1 的紅色素濾液3 mL，然后將等量的0.01 moL/L 金屬化合物[FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2]及硫酸銨溶液加入相應(yīng)的試管中，用50%丙酮溶液定容，搖勻。分別取上述4 種含不同鹽的溶液3 mL，在λex=365 nm，700 nm～750 nm 的掃描范圍條件下測(cè)定紅花紅色素的熒光性能，見圖5。

圖5 金屬離子對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊慒ig.5 Effect of metal ion to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

由圖5 可知，Pb2+、Al3+、Fe2+離子的存在，使得紅花紅色素的熒光性能增強(qiáng)。一般而言，鋁離子可能與紅色素形成配合物，使紅色素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，峰位發(fā)生變化，重金屬離子會(huì)使物質(zhì)的熒光性能產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象，但實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果卻正好相反，峰位沒(méi)有發(fā)生變化，而重金屬離子使紅色素的熒光性能增強(qiáng)。而（NH4）2SO4的影響不大，為以后用硫酸銨/丙酮雙水相提取紅花紅色素提供參考。

2.6 水溶劑對(duì)紅花黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/h3>

取3 mL 的蒸餾水，在激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，在460 nm～550 nm 的掃描范圍條件下，測(cè)定蒸餾水的熒光性能。用同樣的方法，取3 mL 的水溶劑提取液，置于熒光分析皿中，測(cè)定提取液的熒光性能，見圖6。

圖6 水作溶劑中紅花黃色素?zé)晒庑訤ig.6 Fluorescentspectral properties of safflower yellow in water

由圖6 得知，水作溶劑在460 nm～550 nm 波長(zhǎng)掃描范圍內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)波峰，表明在485 nm 處的波峰是由黃色素產(chǎn)生的。

2.7 熒光分析中黃色素用量的選取

取5 只10 mL 比色管，用微量取液器分別加黃色素提取液60、90、120、150、180 μL 于比色管中，再用蒸餾水定容。在室溫條件下，分別取上述五種濃度的溶液各3 mL，激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，掃描范圍在460 nm～550 nm 得到一系列熒光發(fā)射曲線，見圖7。

圖7 黃色素用量對(duì)熒光性能的影響Fig.7 Effect of safflower yellowcontent to fluorescent spectral properties

由圖7 可知，提取液用量為120 μL 時(shí)紅花黃色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。當(dāng)用量大于120 μL 時(shí)熒光強(qiáng)度呈減弱的趨勢(shì)，推測(cè)其原因黃色素濃度較大時(shí)，激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生熒光自熄滅現(xiàn)象。

2.8 溫度對(duì)紅花黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/h3>

取6 只10 mL 比色管，分別加入黃色素樣品濾液120 μL，用蒸餾水定容，搖勻。將比色管放入水浴鍋中，溫度控制在25、35、50、65、80、90 ℃等溫度下水浴2 min，冷卻至室溫。分別取上述六種溫度的溶液各3mL，在激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，掃描范圍：460 nm～550 nm 條件下測(cè)定不同溫度環(huán)境下紅花黃色素的熒光性能，見圖8。

圖8 溫度對(duì)紅花黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊慒ig.8 Effect of temperature to fluorescent spectral propertiesof safflower yellow

由圖8 可知，隨著溫度的提高紅花黃色素的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，其中90 ℃時(shí)黃色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度最弱，25 ℃時(shí)黃色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。推測(cè)其可能的原因是，溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度減小，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞幾率增加，從而使分子無(wú)輻射躍遷增加，熒光效率降低。

2.9 pH 對(duì)紅花黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊?/h3>

取10 只100 mL 玻璃燒杯，各加入蒸餾水50 mL，用0.2 moL/L 氫氧化鈉和0.1 moL/L 硫酸溶液分別調(diào)節(jié)酸堿度使10 只燒杯中的pH 從1～10 排列，分別取上述10 種不同pH 的溶液各3 mL，各加入黃色素樣品濾液40 μL，室溫下在激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，掃描范圍：460 nm～550 nm 條件下測(cè)定不同pH 環(huán)境下紅花黃色素的熒光性能，見圖9。

圖9 pH 對(duì)黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊慒ig.9 Effect of pH to fluorescent spectral propertiesofsafflower yellow

由圖9 可知，黃色素溶液的pH 在1～3 時(shí)，溶液的熒光性能逐漸增強(qiáng)，pH=3 時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。黃色素溶液的pH 在3～10 時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。推測(cè)其原因：黃色素溶液的pH 減小，因質(zhì)子化作用-O（C5H11O5）變成-OH+（C5H11O5），使得左端的氧吸電子作用增強(qiáng)，與羰基間位連接的C=C 雙鍵發(fā)生斷裂，羰基間位的C 與-OH+（C5H11O5）左端的氧形成新鍵，從而形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此時(shí)羰基臨位的C 顯正電性，容易發(fā)生烯醇互變異構(gòu)現(xiàn)象，使得環(huán)狀結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，熒光性能也較強(qiáng)，當(dāng)pH＜3 時(shí)使得環(huán)上的-OH 容易形成-OH2+發(fā)生脫落，給電子基團(tuán)減少，所以熒光性能較弱。

2.10 金屬離子對(duì)紅花黃色素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

取3 只10 mL 比色管，分別加入黃色素樣品濾液120 μL，將等量0.01 moL/L 金屬化合物[FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2]加到相應(yīng)的比色管中，用蒸餾水定容，搖勻。分別取上述3 種含不同金屬離子的溶液3 mL，室溫下在激發(fā)波長(zhǎng)λex=242 nm，掃描范圍：460 nm～550 nm 條件下測(cè)定紅花黃色素的熒光特性，見圖10。

圖10 金屬離子對(duì)紅花黃色素?zé)晒馓匦缘挠绊慒ig.10 Effect of metal ion to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

由圖10 可知，Pb2+、Al3+、Fe2+離子的存在，使得紅花黃色素的熒光性能增強(qiáng)，推測(cè)其原因：一般而言，鋁離子可能與黃色素形成配合物，使黃色素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致峰位發(fā)生變化；而重金屬離子會(huì)使物質(zhì)的熒光性能產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象，但實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果卻正好相反，峰位沒(méi)有發(fā)生變化，且重金屬離子使黃色素的熒光性能增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別提取紅花紅、黃色素，分別進(jìn)行熒光分析性能檢測(cè)，分析溶劑、溫度、pH、金屬離子對(duì)紅花紅、黃色素?zé)晒庑阅艿挠绊?。?shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

1）紅花紅色素50%丙酮溶液熒光性能實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：λex=365 nm，λem=735 nm，在pH=1，溫度25 ℃時(shí)，紅花紅色素?zé)晒鈴?qiáng)度最大，金屬離子（Fe2+、Pb2+、Al3+）使紅色素?zé)晒庑阅茉鰪?qiáng)，而（NH4）2SO4對(duì)紅花紅色素?zé)晒庑阅艿挠绊懖淮蟆?/p>

2）紅花黃色素水溶劑熒光性能實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：λex=242 nm，λem=485 nm，在pH=3、溫度25 ℃時(shí)，紅花黃色素?zé)晒鈴?qiáng)最大，金屬離子（Fe2+、Pb2+、Al3+）使黃色素?zé)晒庑阅茉鰪?qiáng)。而文獻(xiàn)報(bào)道[10]中紅花甲醇提取液熒光性能研究結(jié)果為：λex=340 nm，λem=440 nm，紅花色素在pH=12 的堿性環(huán)境中所發(fā)出的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。

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